Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

1. Levamisol testi için plakaların hazırlanması 3 g NaCl, 2.5 g pepton ve 17 g agar’ı karıştırma çubuğuna sahip bir şişede 1 L deiyonize (DI) su ile birleştirerek nematod büyüme ortamı (NGM) ortamı hazırlayın. Otoklavlamadan sonra, ortamı 70 ° C’ye ayarlanmış bir sıcak plakaya koyun ve 1 saat boyunca ılımlı bir hızda karıştırın. Çökelmeyi önlemek için damla damlasına 1 mL 5 mg/mL kolesterol, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4 ve 25 mL 1 M pH 6.0 potasyum fosfat tamponu ekleyin. 2 mL NGM ortamını, steril bir serolojik pipet ile 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 1). Bakterilerle tohumlamadan önce plakaların tezgahta 2 gün kurumasını bekleyin. Daha uzun süreli depolama için, bunları 4 ° C’ye yerleştirin. OP50 E. coli’yi bir lizojen et suyu (LB) plakasına çizin ve 37 ° C’de gece boyunca büyüyün. B-suyuna tek bir OP50 kolonisi seçin (1 L DI H2O’da 10 g tripton ve 5 g NaCl) ve kültürü gece boyunca 37 ° C’de sallayın. Steril bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğun ortasındaki agarın üzerine 30 μL OP50 süspansiyonu bırakın (Şekil 1).NOT: Agar yüzeyine zarar vermediğinizden emin olun, çünkü bu solucan yuvasına yol açacaktır. Bakteriyel bir çimin oluşmasına izin vermek için plakaları tohumlamadan sonra en az 2 gün oda sıcaklığında bekletin.NOT: Merkez kuyucuklardaki bakteriler 2 gün sonra kurumazsa, plakaları kaputta 20 dakika açık bırakın (Şekil 1). Plakalar tahlilden 1-2 hafta önce dökülmeli ve bakterilerle tohumlanmalıdır. 2. C. elegans’ı senkronize etme (1. gün) Vahşi tip, unc-63 (x26), lev-10 (x17) ve unc-49 (e407) C. elegans’ı 6 cm’lik plakalarda yetişkinliğe kadar yetiştirin, gerinim başına en az sekiz plaka hazırlayın. Plakalarda açlıktan ölmeyen birçok yerçekimi yetişkini olduğunu doğrulayın.NOT: Bu, gerekenden iki kat daha fazla plakadır; Bununla birlikte, ağartma sırasında ilk yumurta partisinin tahrip olması durumunda yedek plakalara sahip olmak önemlidir. 750 mL DI suyunda 59.6 g Na 2 HPO 4 (dibasic), 29.9 g KH 2 PO 4 (monobazik), 12.8 g NaCl ve2.5gMgSO4’ü karıştırarak10x M9 tamponu yapın. Çözüldükten sonra, hacmi 1 L’ye kadar getirin ve sterilize edin. 1x M9 tampon oluşturmak için 1:10 ve otoklav seyreltin.NOT: 1x M9 tampon belleği haftalar veya aylar öncesinden yapılabilir. Senkronizasyon gününde kaputun altında ağartma çözeltisi hazırlayın. 50 mL’lik konik bir tüpte 10 mL ağartıcı (Malzeme Tablosu), 2,5 mL 10 N NaOH ve 37,5 mL DI suyu karıştırın. Ağartma solüsyonuyla çalışırken gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, gravid yetişkin solucanları 1x M9 tampon ile en az dört plakadan yıkayın ve bunları 15 mL konik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 716 x g’de döndürün ve ardından bir transfer pipeti kullanarak süpernatantı çıkarın. 10 mL beyazlatma çözeltisi ekleyin. Solucan karkaslarının çoğu çözünene kadar tüpü ~ 4 dakika boyunca ters çevirin veya hafifçe sallayın (Şekil 1).NOT: Solucanları aşırı ağartmamaya dikkat edin, çünkü bu yumurtaları yok edecektir. Bazı mutasyonlar yumurta izolasyonunun zorluğunu artırabilir. 1 dakika boyunca 716 x g’de döndürün. Ağartıcı çözeltisini tek bir hareketle dökün; tüp bu noktada çalkalanmadığı sürece, yumurtalar tüpün yan tarafına yapışacaktır. 15 mL 1x M9 tampon ekleyin ve ters çevirin. 1 dakika boyunca 716 x g’de döndürün ve M9 tamponunu tek bir yumuşak hareketle dökün. Adım 2.9’da açıklandığı gibi 1x M9 tamponla toplamda üç yıkama gerçekleştirin. Son yıkamadan sonra, 10 mL taze 1x M9 ekleyin ve aç ilk larva (L1) evre hayvanlarının senkronize bir popülasyonunu izole etmek için 15 ° C’de gece boyunca bir rotatöre yerleştirin.NOT: Döndürücüye yerleştirmeden önce, M9 tamponunda yumurta olduğundan emin olun. Değilse, hazırlığı yedek plakalarla tekrarlayın ve daha kısa bir süre için ağartın. 3. Kaplama senkronize C. elegans (2. gün) 24 kuyulu bir plaka haritası yazdırın ve rastgele yerlere gerinimler atayın. Her bir gerinim, 24 delikli plakada en az altı kez temsil edilmelidir. Ağartıcı hazırlığından yaklaşık 24 saat sonra, yumurtadan çıkmış aç L1 solucanlarını M9 tamponunda 716 x g’de oda sıcaklığında 1 dakika boyunca döndürün. ~9 mL M9 tamponunu plastik bir transfer pipeti ile çıkarın ve ardından açlıktan ölen ilk larva aşaması solucanlarını (L1’ler) kalan M9 tamponunda yavaşça karıştırın. Hemen M9 tamponundaki solucanların 3 μL’sini mikroskop sürgüsüne pipetin ve L1’lerin sayısını belirleyin; İstenilen sayı 3 μL’de 20-30 L1’dir. Solucan konsantrasyonu çok düşükse M9’u aşağı doğru döndürün ve çıkarın ve konsantrasyon çok yüksekse M9 ekleyin.NOT: 3 μL başına solucan sayısını en az 2x kontrol edin ve her seferinde tüpü ters çevirin. Pipet 3 μL L1s (toplam 20-30 solucan) önceden hazırlanmış plaka haritasına göre her bir kuyucuğun içine (adım 3.1; Şekil 1).NOT: Solucanların dibe çökecekleri için eşit bir dağılımını korumak için tüpü M9’daki L1’lerle sık sık ters çevirin. Bu yapılmazsa, bazı kuyularda çok az solucan bulunurken, diğerlerinde çok fazla solucan olacaktır. Ayrıca, agar’ı pipet ucuyla delmeyin, çünkü bu hayvanların yuvalanmasına neden olur. Solucanların 20 ° C’de 3 gün boyunca yetişkinliğe kadar büyümesine izin verin.NOT: Farklı büyüme sıcaklıklarının ve belirli mutasyonların kullanılması olgunlaşma hızını etkileyebilir, bu nedenle C. elegans yaşam döngüsünü göz önünde bulundurduğunuzdan emin olun. 4. Levimalol testinin yapılması (5. gün) Her kuyucukta 1 saat boyunca her 5 dakikada bir hareket eden solucan sayısını kaydetmek için kullanılacak boş bir veri sayfası yazdırın.NOT: Öğrenciler her 5 dakikada bir en fazla 12 kuyudaki solucanları sayabileceklerdir. En üstteki 12 kuyu ilk saatte, en alttaki 12 kuyu ise sonraki saatte tahlil edilir. 24 delikli plakalardaki solucanları kontrol edin. Bir işaretleyici kullanarak, kontaminasyonu olan, açlıktan ölen veya saymayı zorlaştıracak çok fazla solucanı (>40) olan kuyucukların üzerinde plaka kapağında bir “X” yapın. 50 mL 1x M9’a 200 μL 100 mM levamisol stoğu ekleyerek 0,4 mM levamisol çözeltisi yapın. 240.76 mg levamisol hidroklorürü 10 mLH2O içinde çözerek 100 mM levamisol stoğu hazırlayın ve -20 ° C’de saklayın.NOT: Levamisol M9’da seyreltilmelidir; H2 O’daseyreltme felci hızlandırır. Öğrenciler eldiven giymelidir. Yüksek konsantrasyonlarda levamisol alımı toksiktir. Bir zamanlayıcı başlatın ve daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, hayvanların serbestçe yüzdüğü ilk iki kuyucuğa 1 mL 0,4 mM levamisol ekleyin. Bitişik kuyulara levamisol eklemeye devam edin, zamanı test edilecek kuyu sayısına göre şaşırtın.NOT: Örneğin, 10 kuyu tahlil edilirse, levamisol şu şekilde eklenecektir: 0 numaralı kuyu 1 ve 2 kuyusu, 1 dakika sonra 3 ve 4 numaralı kuyular, 2 dakika sonra kuyu 5 ve 6, 3 dakika sonra 7 ve 8 numaralı kuyular ve 4 dakika sonra 9 ve 10 numaralı kuyular. 5 dakikada, ilk kuyudan başlayarak her bir kuyucuktaki yalnızca hareketli solucan sayısını manuel olarak saymaya başlayın ve bu sayıyı veri sayfasına kaydedin (Şekil 1). Sayaçlar kullanılabilir, ancak hareketli solucanların sayısını doğru bir şekilde belirlemek için gerekli değildir.NOT: Öğrencilerin zamanlayıcıya dikkat etmeleri gerekir, çünkü birçok solucan felç olmadan önce bazen erken zaman noktalarında geride kalırlar. Zaman noktalarının sayısı ayarlanabilir veya gerekirse her zaman noktasında daha az kuyu test edilebilir. Her kuyucuktaki hareketli solucanların sayısını 1 saat boyunca her 5 dakikada bir saymaya devam edin.NOT: M9’a daldırma, bu 1 saatlik test boyunca sürekli yüzme hareketini indükler, bu da felci değerlendirmek için solucanların dürtülmesi ihtiyacını ortadan kaldırır (Şekil 2A). 0.4 mM levamisol çözeltisine maruz kalmak, yüzmenin kesilmesiyle gözlendiği gibi zamana bağlı felci indükler; felç eden solucanlar iyileşmez. 4.4.-4.6 arasındaki adımları yineleyin. plakadaki kuyuların geri kalanı için. Tahlilin sonunda veya zaman izin verdiğinde, her bir kuyucuktaki toplam solucan sayısını kaydedin. 5. Veri analizi Plaka haritasını edinin (adım 3.1.) ve her bir kuyucuğa hangi gerinimin karşılık geldiğini kaydedin.NOT: Toplanan veri miktarı nedeniyle, verilerin daha sonra analiz edilmesi ve tartışılması en az birkaç saat sürecektir. Her bir kuyucuktaki toplam solucan sayısından başlayarak ve genotipe göre düzenleyerek verileri bir elektronik tabloya girin. Kuyulardan gelen verileri birleştirerek, her suş için her zaman noktasında hareket eden solucanların sayısını belirleyin. Bu verileri, popülasyonun zamana bağlı felcini görsel olarak görüntülemek için istatistiksel yazılımda (Malzeme Tablosu) bir “hayatta kalma eğrisi” oluşturmak için kullanın (Şekil 2B). Sol sütunda zamanı gösterecek ve sonraki sütunlar her gerinim için verileri içerecek şekilde bir veri tablosu oluşturun. İlk 5 dakika içinde felç olan her hayvan için bir satır oluşturun ve 5 dakika boyunca bir “1” girin. Bunu her zaman noktası için tekrarlayın. Tahlilin sonunda felç olmayan tüm hayvanlar için, 60 dakika boyunca bir “0” girin. İki farklı suş arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirlemek için istatistiksel yazılımdaki (Malzeme Tablosu) log-rank (Mantel-Cox) testini kullanarak ikili karşılaştırmalar yapın. Ek / alternatif analiz için, adım 5.3’ü gerçekleştirmek yerine. ve adım 5.4., her zaman noktasında her kuyucukta hareket eden hayvanların yüzdesini belirleyin. Bir elektronik tablo programı veya istatistiksel yazılım kullanılarak test edilen tüm suşlar için her zaman noktasında standart hata ile ortalamayı çizin (Şekil 2C).