قياس حساسية Caenorhabditis elegans لمستقبلات الأسيتيل كولين ناهض ليفاميزول
Summary
يصف هذا البروتوكول فحصا لتحديد الاستجابة لليفاميسول ، وهو ناهض دوائي لفئة واحدة من مستقبلات Caenorhabditis elegans acetylcholine. في اختبار السباحة الليفاميزول السائل هذا ، يلاحظ الباحثون بصريا ويقدرون الشلل المعتمد على الوقت للحيوانات المزروعة في ألواح 24 بئرا.
Abstract
عند التقاطع العصبي العضلي (NMJ) ، يؤدي ربط الناقل العصبي المثير أستيل كولين (ACh) بمستقبلات ما بعد المشبكي إلى تقلص العضلات. كما هو الحال في العضلات الهيكلية الفقارية ، مطلوب الإشارات الكولينية في عضلات جدار الجسم للكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans للحركة. التعرض لليفاميسول ، وهو ناهض دوائي لفئة واحدة من مستقبلات ACh على عضلات جدار الجسم ، يسبب شللا يعتمد على الوقت للحيوانات البرية. تشير الحساسية المتغيرة للليفاميزول إلى وجود عيوب في الإشارات في NMJ أو وظيفة العضلات. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص ليفاميزول السائل الذي يتم إجراؤه على C. elegans المزروع في لوحات 24 بئرا. تسمح السباحة القوية للحيوانات في السائل بتقييم وقياس الشلل الناجم عن الليفاميزول في مئات الديدان على مدى ساعة زمنية واحدة دون الحاجة إلى التلاعب المادي. يمكن استخدام هذا الإجراء مع كل من النوع البري والمتحورات التي غيرت الحساسية للليفاميزول لإظهار العواقب الوظيفية للإشارات المتغيرة في NMJ.
Introduction
يؤدي تنشيط مستقبلات الأسيتيل كولين بعد المشبكي (AChRs) على العضلات الهيكلية إلى إشارة كهربائية تؤدي إلى تقلص العضلات. اضطراب الوظيفة العصبية العضلية يؤدي إلى متلازمات الوهن العضلي وضمور العضلات في البشر1،2،3،4. تم استخدام الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans على نطاق واسع للتعرف على العمليات البيولوجية الأساسية المحفوظة تطوريا وآليات المرض. عضلات الهيكل العظمي الفقارية وعضلات جدار الجسم C. elegans مكافئة وظيفيا في التحكم في الحركة5. هنا ، يتم تقديم فحص بسيط يمكن استخدامه لمقارنة C. elegans من النوع البري مع الطفرات التي غيرت الإشارات العصبية العضلية أو وظيفة العضلات.
تتسبب المدخلات المثيرة والمثبطة الواردة من الخلايا العصبية الحركية الكولينية و GABAergic ، على التوالي ، في تقلص العضلات على جانب واحد من جسم C. elegans بينما تسترخي العضلات الموجودة على الجانب الآخر ، مما يتيح الحركة المنسقة6. Levamisole ، وهو عامل مضاد للديدان يستخدم لعلاج عدوى الديدان الخيطية الطفيلية ، يرتبط وينشط بشكل أساسي فئة واحدة من AChRs على عضلات جدار الجسم ، مما يؤدي إلى شلل يعتمد على الوقت7. وبالتالي ، يمكن استخدام الحساسية المتغيرة للليفاميزول لتحديد C. elegans مع عيوب في توازن الإشارات المثيرة والمثبطة 7,8,9,10,11,12,13,14,15. على سبيل المثال ، الطفرات في الوحدات الفرعية من AChR الحساسة لليفاميزول (L-AChR) ، مثل UNC-63 ، وكذلك تجانس C. elegans من Cubilin ، LEV-10 ، وهو مطلوب لتجميع L-AChR في المشبك ، وتأثير الإشارات المثيرة ويؤدي إلى مقاومة الليفاميزول 7,8. الطفرات في مستقبلات GABAA UNC-49 تقلل من الإشارات المثبطة وتسبب فرط الحساسية للليفاميزول12.
تم تقييم فرط الحساسية أو مقاومة الليفاميزول تقليديا عن طريق نقل الحيوانات إلى ألواح أجار التي تحتوي على ليفاميزول ثم حث الديدان بانتظام لتحديد النقطة الزمنية التي يحدث فيها الشلل13،14،15. لقد طورنا مقايسة سباحة ليفاميزول سائلة تلغي الحاجة إلى التلاعب المادي بالحيوانات وتسمح بفحص مئات الحيوانات في 1 ساعة فقط. هنا ، يتم وصف استخدام هذا الفحص مع الحيوانات من النوع البري ، unc-63 (x26) ، lev-10 (x17) ، و unc-49 (e407). ومع ذلك ، يمكن أيضا إجراء هذا البروتوكول على C. elegans المعرضة ل RNAi ، كما حدث للتحقق من صحة الضربات القاضية المحددة في شاشة RNAi على مستوى الجينوم لحساسية ليفاميزول المتغيرة11.
بالنسبة لهذا الفحص الدوائي ، نمت الديدان حتى سن البلوغ في لوحات 24 بئرا ، وتمت إضافة 0.4 mM levamisole في المخزن المؤقت M9 إلى كل بئر ، وتم تسجيل عدد الحيوانات المتحركة كل 5 دقائق لمدة 1 ساعة. لوحظ الشلل الناجم عن ليفاميسول بصريا بمرور الوقت ، وبعد الانتهاء من الفحص ، تم تحديد البيانات كميا. يسمح تقييم الطفرات جنبا إلى جنب مع C. elegans من النوع البري للطلاب بإجراء تنبؤات حول تأثيرات النمط الظاهري المحتملة أولا ثم إجراء تجارب لاختبار فرضياتهم. في الختام ، يعد هذا الفحص البسيط وغير المكلف والسائل ليفاميزول طريقة مثالية لإثبات تأثير فقدان جينات معينة على وظيفة NMJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن للاستجابة المتغيرة لليفاميزول تحديد الجينات اللازمة للإشارات الكولينية بعد المشبكي ووظيفة العضلات. يصف البروتوكول هنا فحص ليفاميزول السائل المستخدم لقياس الشلل المعتمد على الوقت على مدى فترة زمنية مدتها 1 ساعة. يقوم الطلاب بإجراء تنبؤات حول آثار بعض الطفرات الجينية ، وإجراء تجربة بحجم عينة كبير ، ثم تحديد نتائجهم. هذا الفحص هو وسيلة بسيطة وفعالة لقياس الشلل الناجم عن الليفاميزول دون انتقاء الحيوانات أو حثها ، مما يجعلها مناسبة للمختبرات الجامعية ، وكذلك الباحثين الذين يدرسون الانتقال العصبي العضلي. نوقشت هنا بعض المزالق الأكثر شيوعا ، وقيود الفحص ، واختلاف البروتوكول الذي يمكن من استخدامه مع RNAi القاضية. كما نوقش هنا كيف يمكن تضمين هذا الفحص في تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة التدريبية.
التحضير السليم للوحات 24 بئر أمر ضروري. أولا ، يجب أن تكون المروج البكتيرية جافة تماما قبل اكتشاف L1 في الآبار. إذا لم يتم تجفيفها بما فيه الكفاية ، فإن البكتيريا تختلط بمحلول الليفاميزول أثناء الفحص ، مما يحول السائل إلى غائم ويمنع الأفراد من القدرة على حساب الديدان. ثانيا ، عند مزامنة الديدان من خلال إعداد التبييض ، يجب ألا تتعرض الحيوانات لمحلول التبييض لفترة طويلة جدا لأن هذا سيؤدي إلى تفكك الطبقة الواقية على البيض. ثالثا ، من الأهمية بمكان تحديد 20-30 L1s فقط لكل بئر ، لأن الكثير من الديدان في الآبار تجعل من الصعب للغاية حساب العدد الذي يتحرك بدقة في الوقت المخصص. أخيرا ، من المهم الحفاظ على تقنية معقمة أثناء إعداد الألواح حيث لا يمكن فحص الآبار الملوثة.
هناك بعض القيود التي يجب مراعاتها عند إجراء هذا الفحص. أولا، قد يكون حساب عدد الديدان المتحركة في كل بئر كل 5 دقائق أمرا ساحقا للأفراد الذين يفتقرون إلى الخبرة المختبرية السابقة، وقد يؤدي ذلك إلى جمع بيانات غير دقيقة. أما بالنسبة للفحوصات الأخرى المستخدمة لتحديد حساسية الدواء18,19 ، فيمكن إجراء هذه التجربة بنقاط زمنية أقل. ثانيا ، يعد طلاء L1s الجائع المعزول من إعداد التبييض طريقة سهلة للحصول على مجموعة متزامنة. ومع ذلك ، يجب إجراء تعديلات إذا كان توقيت التطوير يختلف بين السلالات التي يتم فحصها. من الممكن اختيار المرحلة الرابعة المتأخرة من اليرقات (L4s) في لوحة من 24 بئرا لهذا الفحص ؛ ومع ذلك ، عند إعداد العديد من اللوحات ، يكون هذا كثيف العمالة. بدلا من ذلك ، ينبغي للمرء أن يحدد طول الوقت الذي تستغرقه كل سلالة للوصول إلى L4 ثم وضع L1s في الآبار في أوقات مختلفة للتكيف مع الاختلافات في سرعة النضج. أخيرا ، في حين يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد الجينات الجديدة المهمة لوظيفة العضلات ما بعد المشبكي11 ، يمكن أيضا أن تحدث استجابة ليفاميزول المتغيرة بسبب طفرة أو ضربة قاضية RNAi للجينات قبل المشبكي12. إذا لوحظت حساسية ليفاميزول متغيرة ، فيجب إجراء تجارب إضافية لتحديد سبب هذا النمط الظاهري.
من خلال إجراء بعض التعديلات على لوحات 24 بئرا ، يمكن أيضا إجراء فحص السباحة ليفاميزول الموصوف على RNAi القاضية11. يمكن تحقيق ضربة قاضية للجين من خلال الحمض النووي الريبي عن طريق تغذية بكتيريا C. elegans التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل المقابلة للجين محل الاهتمام20. لإعداد لوحات RNAi ، يجب إضافة 1 مل من 1M IPTG و 1 مل من 25 ملغ / مل من كاربينيسيلين لكل لتر من الوسائط بعد إزالتها من الأوتوكلاف. تزرع المزارع البكتيرية عن طريق اختيار مستعمرة واحدة إلى 3 مل من مرق LB بالإضافة إلى 3 ميكرولتر من 25 ملغ / mLcarbenicillin ، وتهتز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، ويتم عمل خريطة اللوحة عندما يتم رصد البكتيريا المختلفة في الآبار. C. تتم مزامنة elegans بواسطة إعداد التبييض كما هو موضح ؛ ومع ذلك ، يجب استخدام سلالة RNAi شديدة الحساسية eri-1 (mg366) بدلا من النوع البري لزيادة ضربة القاضية للجينات. تؤدي ضربات RNAi القاضية إلى نفس الأنماط الظاهرية للليفاميزول التي لوحظت للطفرات المفقودةللوظيفة 11.
يمكن استخدام البروتوكول المعروض هنا في الأبحاث المختبرية ، كتجربة قائمة بذاتها في المختبر الجامعي ، أو في الأسابيع الأولى من دورة جامعية متقدمة كمقدمة لتقنيات C. elegans الأساسية والوظيفة العصبية العضلية. في دورة أكثر تقدما قائمة على الاكتشاف ، يمكن للطلاب استخدام هذا الفحص لتحديد ما إذا كان فقدان متجانسات C. elegans للجينات المتحورة في الأفراد الذين يعانون من متلازمات الوهن العضلي أو الضمور العضلي أو الاعتلالات العضلية يغير حساسية الليفاميزول. في الختام ، يوفر اختبار حساسية الليفاميزول البسيط وغير المكلف هذا نهجا عمليا للتعلم عن الإشارات في NMJ واكتساب الخبرة في العمل مع نظام نموذج C. elegans.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ريا داتاني ولورين هوغستروم ، اللذين جمعا البيانات في الشكل 2B ، C الأعمى عن النمط الوراثي في مختبر BISC413 المتقدم لعلم الوراثة (ربيع 2022) في جامعة ديلاوير. تتوفر معلومات إضافية حول تجربة البحث الجامعي القائمة على الدورة التدريبية BISC413 (CURE) ، بالإضافة إلى الوصول إلى دليل المختبر الذي صممه J. Tanis ، عند الطلب. تم توفير سلالات الديدان الخيطية من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center ، الذي تدعمه NIH-ORIP (P40 OD010440). تم دعم هذا العمل من خلال جائزة P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (إلى J.E.T).
Materials
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
