Medindo a sensibilidade de Caenorhabditis para o Receptor acetilcolina Agonista Levamisole

1. Preparação de placas para o ensaio de levamisole Prepare a mídia média de crescimento nematode (NGM) combinando 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone e 17 g de ágar com 1 L de água desionizada (DI) em um frasco com uma barra de mexida. Depois de autoclaving, coloque a mídia em uma placa quente definida para 70 °C e mexa a uma velocidade moderada por 1h. Adicione 1 mL de colesterol de 5 mg/mL em sentido gotílico para evitar a precipitação, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4 e 25 mL de 1 M pH 6.0 tampão fosfato de potássio para a mídia. Transfira 2 mL de mídia NGM em cada poço de uma placa de 24 poços com uma pipeta sorológica estéril (Figura 1). Deixe as placas secarem no banco por 2 dias antes de semear com bactérias. Para armazenamento a longo prazo, coloque-os a 4 °C. Listra para fora OP50 E. coli em uma placa de caldo de lysogeny (LB) e crescer durante a noite a 37 °C. Escolha uma única colônia OP50 em caldo B (10 g de triptona e 5 g de NaCl em 1 L de DI H2O) e coloque a cultura tremendo a 37 °C durante a noite. Usando uma tubulação estéril, solte 30 μL de suspensão OP50 no ágar no meio de cada poço (Figura 1).NOTA: Certifique-se de não danificar a superfície do ágar, pois isso levará à escavação de vermes. Deixe as placas sentarem-se à temperatura ambiente por pelo menos 2 dias após a semeadura para permitir que um gramado bacteriano se forme.NOTA: Se a bactéria nos poços centrais não estiver seca após 2 dias, deixe as placas abertas no capô por 20 minutos (Figura 1). As placas devem ser derramadas e semeadas com bactérias de 1 a 2 semanas antes do ensaio. 2. Sincronizando C. elegans (dia 1) Cresça do tipo selvagem, unc-63(x26), lev-10(x17), e unc-49(e407) C. elegans até a idade adulta em placas de 6 cm, preparando pelo menos oito placas por cepa. Confirme que há muitos adultos não famintos nas placas.NOTA: Esta é o dobro de placas que o necessário; no entanto, é importante ter placas de backup no caso do primeiro lote de ovos ser destruído durante o branqueamento. Faça 10x M9 tampão dissolvendo 59,6 g de Na2HPO4 (dibasic), 29,9 g de KH2PO4 (monobásico), 12,8 g de NaCl e 2,5 g de MgSO4 em 750 mL de água DI com agitação. Uma vez dissolvido, leve o volume até 1 L e o filtro seja esterilizado. Diluir 1:10 e autoclave para fazer 1x tampão M9.NOTA: O buffer 1x M9 pode ser feito semanas ou meses de antecedência. Prepare a solução de branqueamento sob o capô no dia da sincronização. Misture 10 mL de alvejante (Tabela de Materiais), 2,5 mL de 10 N NaOH e 37,5 mL de água DI em um tubo cônico de 50 mL. Use óculos, luvas e um jaleco sempre que trabalhar com a solução de branqueamento. Usando um tubo de transferência de plástico, lave vermes adultos gravid de pelo menos quatro placas com tampão 1x M9 e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL. Gire a 716 x g por 1 min a temperatura ambiente e, em seguida, remova o supernante usando uma tubulação de transferência. Adicione 10 mL da solução de branqueamento. Inverter ou agitar suavemente o tubo por ~4 min até que a maioria, mas não todas, as carcaças de vermes tenham dissolvido (Figura 1).NOTA: Tenha cuidado para não branquear demais os vermes, pois isso destruirá os ovos. Certas mutações podem aumentar a dificuldade de isolamento dos ovos. Gire em 716 x g por 1 min. Despeje a solução de alvejante em um movimento; enquanto o tubo não estiver abalado neste momento, os ovos grudarão na lateral do tubo. Adicione 15 mL de tampão M9 1x e inverta. Gire a 716 x g por 1 min, e despeje o tampão M9 em um movimento suave. Realize três lavagens no total com tampão M9 1x, conforme descrito na etapa 2.9. Após a lavagem final, adicione 10 mL de 1x M9 fresco e coloque em um rotador durante a noite a 15 °C para isolar uma população sincronizada de animais de estágio primeiro larval (L1) famintos.NOTA: Antes de colocar no rotador, verifique se há ovos no buffer M9. Se não, repita a preparação com placas de backup e alvejante por um tempo menor. 3. Chapeamento sincronizado C. elegans (dia 2) Imprima um mapa de placas de 24 poços e atribua cepas a lugares randomizados. Cada cepa deve ser representada na placa de 24 poços pelo menos seis vezes. Aproximadamente 24 h após a preparação do alvejante, gire para baixo eclodidos vermes L1 famintos em tampão M9 a 716 x g por 1 min em temperatura ambiente. Remova ~9 mL de tampão M9 com um tubo de transferência de plástico e, em seguida, misture suavemente os vermes de estágio larval famintos (L1s) no tampão M9 restante. Insurrea imediatamente 3 μL dos worms no buffer M9 em um slide de microscópio e determine o número de L1s; o número desejado é de 20-30 L1s em 3 μL. Gire para baixo e remova M9 se a concentração do worm estiver muito baixa, e adicione M9 se a concentração for muito alta.NOTA: Verifique o número de worms por 3 μL pelo menos 2x, invertendo o tubo cada vez. Pipet 3 μL de L1s (20-30 worms total) em cada poço de acordo com o mapa da placa pré-feita (passo 3.1; Figura 1).NOTA: Inverta o tubo com os L1s em M9 com frequência para manter uma distribuição uniforme de vermes, pois eles se estabelecerão até o fundo. Se isso não for feito, alguns poços terão poucos vermes, enquanto outros terão muitos. Além disso, não fure o ágar com a ponta pipeta, pois isso fará com que os animais se enterrem. Deixe os vermes crescerem até a idade adulta por 3 dias a 20 °C.NOTA: O uso de diferentes temperaturas de crescimento e certas mutações podem afetar a velocidade de maturação, por isso não deixe de considerar o ciclo de vida C. elegans . 4. Realizando o ensaio de levamisole (dia 5) Imprima uma folha de dados em branco, que será usada para registrar o número de worms movendo-se em cada poço a cada 5 minutos por 1 h.NOTA: Os alunos poderão contar os vermes em no máximo 12 poços a cada 5 minutos. Os 12 melhores poços são avaliados na primeira hora, com os 12 poços inferiores avaliados na hora seguinte. Verifique os vermes nas placas de 24 poços. Usando um marcador, faça um “X” na tampa da placa sobre quaisquer poços que tenham contaminação, tenham passado fome ou tenham muitos vermes (>40), o que dificultará a contagem. Faça solução de levamisole de 0,4 mM adicionando 200 μL de 100 mM de estoque de levamisole a 50 mL de 1x M9. Prepare 100 mM de caldo de levamisole dissolvendo 240,76 mg de cloridrato de levamisole em 10 mL de H2O e armazene-o a −20 °C.NOTA: Levamisole deve ser diluído em M9; diluição em H2O acelera a paralisia. Os alunos devem usar luvas. A ingestão de altas concentrações de levamisole é tóxica. Inicie um temporizador e, em seguida, usando um pipet de transferência, adicione 1 mL de levamisole de 0,4 mM aos dois primeiros poços, de tal forma que os animais estão nadando livremente. Continue adicionando levamisole aos poços adjacentes, cambaleando o tempo de acordo com o número de poços a serem avaliados.NOTA: Por exemplo, se 10 poços forem avaliados, o levamisole será adicionado da seguinte forma: poços 1 e 2 no tempo 0, poços 3 e 4 após 1 min, poços 5 e 6 após 2 min, poços 7 e 8 após 3 min, e poços 9 e 10 após 4 min. Em 5 min, comece contando manualmente apenas o número de vermes em movimento em cada poço, começando com o primeiro poço, e regise esse número na folha de dados (Figura 1). Contadores podem ser usados, mas não são necessários para determinar com precisão o número de worms em movimento.NOTA: Os alunos precisam ficar de olho no temporizador, pois às vezes ficam para trás durante os primeiros momentos antes que muitos vermes paralisem. O número de pontos de tempo pode ser ajustado, ou menos poços podem ser avaliados em cada ponto de tempo, se necessário. Continue a contar o número de vermes em movimento em cada poço a cada 5 minutos por 1 h.NOTA: A imersão em M9 induz o movimento constante da natação ao longo deste ensaio de 1h, o que elimina a necessidade de prodding dos vermes para avaliar a paralisia (Figura 2A). A exposição à solução de levamisole de 0,4 mM induz paralisia dependente do tempo, conforme observado pela cessação da natação; vermes que paralisam não se recuperam. Repetir as etapas 4.4.-4.6. para o resto dos poços na placa. No final do ensaio, ou quando o tempo permitir, registo o número total de vermes em cada poço. 5. Análise de dados Obtenha o mapa da placa (etapa 3.1.) e regise qual cepa corresponde a cada poço.NOTA: Devido à quantidade de dados coletados, a análise e discussão subsequentes dos dados levará pelo menos algumas horas. Insira os dados em uma planilha, começando com o número total de worms em cada poço e organizando por genótipo. Combinando dados dos poços, determine o número de vermes se movendo em cada ponto de tempo para cada cepa. Use esses dados para criar uma “curva de sobrevivência” no software estatístico (Tabela de Materiais) para exibir visualmente a paralisia dependente do tempo da população (Figura 2B). Faça uma tabela de dados de modo que a coluna da mão esquerda indique tempo e as colunas subsequentes contenham os dados de cada cepa. Para cada animal que está paralisado dentro dos primeiros 5 minutos, crie uma linha e digite um “1” por 5 min. Repita isso para cada ponto de tempo. Para todos os animais que não paralisam até o final do ensaio, digite um “0” por 60 min. Realize comparações em pares usando o teste de log-rank (Mantel-Cox) no software estatístico (Tabela de Materiais) para determinar se há uma diferença estatisticamente significativa entre duas cepas diferentes. Para análise adicional/alternativa, em vez de realizar a etapa 5.3. e passo 5.4., determinar a porcentagem de animais que se movem em cada poço em cada ponto de tempo. Plote a média com erro padrão em cada ponto de tempo para todas as cepas avaliadas usando um programa de planilha ou o software estatístico (Figura 2C).