Messung der Empfindlichkeit von Caenorhabditis elegans gegenüber dem Acetylcholinrezeptoragonisten Levamisol

1. Vorbereitung der Platten für den Levamisol-Test Nematodenwachstumsmedium (NGM) werden hergestellt, indem 3 g NaCl, 2,5 g Pepton und 17 g Agar mit 1 l entionisiertem (DI) Wasser in einem Kolben mit einem Rührbalken kombiniert werden. Nach dem Autoklavieren die Medien auf eine auf 70 °C eingestellte Heizplatte legen und 1 h lang mit mäßiger Geschwindigkeit umrühren. Geben Sie 1 ml 5 mg / ml Cholesterin tropfenweise, um Ausfällungen zu verhindern, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 und 25 ml 1 M pH 6,0 Kaliumphosphatpuffer in das Medium. 2 ml NGM-Medien werden mit einer sterilen serologischen Pipette in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte überführt (Abbildung 1). Lassen Sie die Platten 2 Tage auf dem Tisch trocknen, bevor Sie sie mit Bakterien aussäen. Für eine längerfristige Lagerung stellen Sie sie auf 4 °C. Streifen Sie OP50 E. coli auf einer Lysogeny-Brühe (LB) -Platte aus und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Eine einzelne OP50-Kolonie in B-Brühe (10 g Trypton und 5 g NaCl in 1 L DIH2O) pflücken und die Kultur über Nacht auf 37 °C schütteln. Tropfen Sie mit einer sterilen Pipette 30 μL OP50-Suspension auf den Agar in der Mitte jeder Vertiefung (Abbildung 1).HINWEIS: Achten Sie darauf, die Agaroberfläche nicht zu beschädigen, da dies zum Eingraben von Würmern führt. Lassen Sie die Platten nach der Aussaat mindestens 2 Tage bei Raumtemperatur stehen, damit sich ein Bakterienrasen bilden kann.HINWEIS: Wenn die Bakterien in den Mittelmulden nach 2 Tagen nicht trocken sind, lassen Sie die Platten 20 Minuten lang in der Haube offen (Abbildung 1). Die Platten sollten 1-2 Wochen vor dem Test gegossen und mit Bakterien besät werden. 2. Synchronisation von C. elegans (Tag 1) Züchten Sie Wildtyp, unc-63 (x26), lev-10 (x17) und unc-49 (e407) C. elegans bis zum Erwachsenenalter auf 6 cm Platten und bereiten Sie mindestens acht Platten pro Stamm vor. Bestätigen Sie, dass es viele nicht verhungerte Gravid-Erwachsene auf den Tellern gibt.HINWEIS: Dies sind doppelt so viele Platten wie benötigt; Es ist jedoch wichtig, Backup-Platten zu haben, falls die erste Charge Eier während des Bleichens zerstört wird. Machen Sie 10x M9-Puffer, indem Sie 59,6 g Na2HPO4(dibasisch), 29,9 gKH2PO4(einbasisch), 12,8 g NaCl und 2,5 gMgSO4 in 750 ml DI-Wasser unter Rühren auflösen. Nach dem Auflösen das Volumen auf 1 L erhöhen und filtern. 1:10 verdünnen und autoklavieren, um 1x M9-Puffer herzustellen.HINWEIS: Der 1x M9-Puffer kann Wochen oder Monate im Voraus hergestellt werden. Bereiten Sie die Bleichlösung am Tag der Synchronisierung unter der Haube vor. Mischen Sie 10 mL Bleichmittel (Table of Materials), 2,5 mL 10 N NaOH und 37,5 mL DI-Wasser in einem 50 mL konischen Röhrchen. Tragen Sie eine Schutzbrille, Handschuhe und einen Laborkittel, wenn Sie mit der Bleichlösung arbeiten. Mit einer Kunststoff-Transferpipette gravide adulte Würmer von mindestens vier Platten mit 1x M9-Puffer waschen und in ein 15 ml konisches Röhrchen überführen. Bei 716 x g 1 min bei Raumtemperatur schleudern und dann den Überstand mit einer Transferpipette entfernen. Fügen Sie 10 ml der Bleichlösung hinzu. Drehen oder schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig für ~4 Minuten, bis sich die meisten, aber nicht alle Wurmkadaver aufgelöst haben (Abbildung 1).HINWEIS: Achten Sie darauf, die Würmer nicht zu bleichen, da dies die Eier zerstört. Bestimmte Mutationen können die Schwierigkeit der Eiisolierung erhöhen. Drehen Sie mit 716 x g für 1 min. Gießen Sie die Bleichlösung in einer Bewegung ab; Solange die Röhre an dieser Stelle nicht geschüttelt wird, bleiben die Eier an der Seite der Röhre haften. 15 mL 1x M9-Puffer hinzufügen und umkehren. Drehen Sie mit 716 x g für 1 Minute und gießen Sie den M9-Puffer in einer sanften Bewegung ab. Führen Sie insgesamt drei Waschgänge mit 1x M9-Puffer durch, wie in Schritt 2.9 beschrieben. Nach dem letzten Waschgang 10 ml frisches 1x M9 hinzufügen und über Nacht bei 15 °C auf einen Rotator legen, um eine synchronisierte Population ausgehungerter Tiere im ersten Larvenstadium (L1) zu isolieren.HINWEIS: Überprüfen Sie vor dem Aufsetzen des Rotators, ob sich Eier im M9-Puffer befinden. Wenn nicht, wiederholen Sie die Vorbereitung mit Backup-Platten und Bleichmittel für eine kürzere Zeit. 3. Beschichtung synchronisierter C. elegans (Tag 2) Drucken Sie eine 24-Well-Plattenkarte aus und weisen Sie Dehnungen zufälligen Stellen zu. Jeder Stamm sollte mindestens sechsmal in der 24-Well-Platte dargestellt werden. Etwa 24 h nach der Bleichmittelvorbereitung geschlüpfte ausgehungerte L1-Würmer im M9-Puffer bei 716 x g für 1 min bei Raumtemperatur herunterdrehen. Entfernen Sie ~ 9 ml M9-Puffer mit einer Kunststofftransferpipette und mischen Sie dann vorsichtig die ausgehungerten Würmer im ersten Larvenstadium (L1s) in den verbleibenden M9-Puffer. Sofort werden 3 μL der Würmer im M9-Puffer auf einen Objektträger pipettiert und die Anzahl der L1s bestimmt; Die gewünschte Anzahl beträgt 20-30 L1s in 3 μL. Drehen Sie M9 herunter und entfernen Sie es, wenn die Wurmkonzentration zu niedrig ist, und fügen Sie M9 hinzu, wenn die Konzentration zu hoch ist.HINWEIS: Überprüfen Sie die Anzahl der Würmer pro 3 μL mindestens 2x, indem Sie die Röhre jedes Mal umdrehen. Pipet 3 μL L1s (insgesamt 20-30 Würmer) in jede Vertiefung gemäß der vorgefertigten Plattenkarte (Schritt 3.1; Abbildung 1).HINWEIS: Drehen Sie das Rohr häufig mit den L1s in M9 um, um eine gleichmäßige Verteilung der Würmer aufrechtzuerhalten, da sie sich am Boden absetzen. Wenn dies nicht getan wird, haben einige Brunnen zu wenige Würmer, während andere zu viele haben. Durchstechen Sie den Agar auch nicht mit der Pipetenspitze, da dies dazu führt, dass sich die Tiere eingraben. Lassen Sie die Würmer 3 Tage bei 20 °C erwachsen werden.HINWEIS: Die Verwendung unterschiedlicher Wachstumstemperaturen und bestimmter Mutationen kann die Reifungsgeschwindigkeit beeinflussen, also achten Sie darauf, den Lebenszyklus von C. elegans zu berücksichtigen. 4. Durchführung des Levamisol-Tests (Tag 5) Drucken Sie ein leeres Datenblatt, mit dem die Anzahl der Würmer, die sich alle 5 Minuten für 1 h in jedem Bohrloch bewegen, aufgezeichnet wird.HINWEIS: Die Schüler können die Würmer in höchstens 12 Brunnen alle 5 Minuten zählen. Die ersten 12 Bohrlöcher werden in der ersten Stunde untersucht, die unteren 12 Bohrlöcher in der folgenden Stunde. Überprüfen Sie die Würmer in den 24-Well-Platten. Machen Sie mit einem Marker ein “X” auf dem Plattendeckel über alle Brunnen, die kontaminiert sind, verhungert sind oder zu viele Würmer haben (>40), was das Zählen erschwert. Stellen Sie 0,4 mM Levamisollösung her, indem Sie 200 μL 100 mM Levamisolschaft zu 50 ml 1x M9 hinzufügen. 100 mM Levamisolvorrat durch Auflösen von 240,76 mg Levamisolhydrochlorid in 10 mlH2Ound Lagerung bei −20 °C vorbereiten.HINWEIS: Levamisol muss in M9 verdünnt werden; Die Verdünnung inH2Obeschleunigt die Lähmung. Die Schüler sollten Handschuhe tragen. Die Einnahme hoher Konzentrationen von Levamisol ist toxisch. Starten Sie einen Timer und geben Sie dann mit einer Transferpipette 1 ml 0,4 mM Levamisol in die ersten beiden Vertiefungen, so dass die Tiere frei schwimmen können. Fügen Sie den benachbarten Bohrlöchern weiterhin Levamisol hinzu und staffeln Sie die Zeit entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Bohrlöcher.HINWEIS: Wenn beispielsweise 10 Bohrlöcher untersucht werden, wird Levamisol auf folgende Weise hinzugefügt: Vertiefungen 1 und 2 zum Zeitpunkt 0, Vertiefungen 3 und 4 nach 1 Minute, Vertiefungen 5 und 6 nach 2 Minuten, Vertiefungen 7 und 8 nach 3 Minuten und Vertiefungen 9 und 10 nach 4 Minuten. Beginnen Sie nach 5 Minuten damit, manuell nur die Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Bohrloch zu zählen, beginnend mit dem ersten Bohrloch, und notieren Sie diese Zahl im Datenblatt (Abbildung 1). Zähler können verwendet werden, sind aber nicht erforderlich, um die Anzahl der sich bewegenden Würmer genau zu bestimmen.HINWEIS: Die Schüler müssen den Timer im Auge behalten, da sie manchmal in frühen Zeiten in Rückstand geraten, bevor viele Würmer lähmen. Die Anzahl der Zeitpunkte kann angepasst werden, oder bei Bedarf können zu jedem Zeitpunkt weniger Bohrlöcher untersucht werden. Zählen Sie weiterhin die Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Brunnen alle 5 Minuten für 1 h.HINWEIS: Das Eintauchen in M9 induziert während dieses 1-stündigen Assays eine konstante Schwimmbewegung, wodurch das Anstoßen der Würmer zur Beurteilung der Lähmung entfällt (Abbildung 2A). Die Exposition gegenüber 0,4 mM Levamisollösung induziert eine zeitabhängige Lähmung, wie sie durch Aufhören des Schwimmens beobachtet wird; Lähmende Würmer erholen sich nicht. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.-4.6. für den Rest der Vertiefungen in der Platte. Am Ende der Untersuchung oder wenn es die Zeit erlaubt, ist die Gesamtzahl der Würmer in jedem Bohrloch aufzuzeichnen. 5. Datenanalyse Ermitteln Sie die Plattenkarte (Schritt 3.1) und notieren Sie, welche Dehnung jeder Vertiefung entspricht.HINWEIS: Aufgrund der Menge der gesammelten Daten dauert die anschließende Analyse und Diskussion der Daten mindestens einige Stunden. Geben Sie die Daten in eine Tabelle ein, beginnend mit der Gesamtzahl der Würmer in jedem Bohrloch und organisieren Sie nach Genotyp. Bestimmen Sie durch die Kombination von Daten aus den Bohrlöchern die Anzahl der Würmer, die sich zu jedem Zeitpunkt für jeden Stamm bewegen. Verwenden Sie diese Daten, um eine “Überlebenskurve” in der statistischen Software (Table of Materials) zu erstellen, um die zeitabhängige Lähmung der Bevölkerung visuell darzustellen (Abbildung 2B). Erstellen Sie eine Datentabelle so, dass die linke Spalte die Zeit angibt und nachfolgende Spalten die Daten für jede Dehnung enthalten. Erstellen Sie für jedes Tier, das innerhalb der ersten 5 Minuten gelähmt ist, eine Reihe und geben Sie eine “1” für 5 Minuten ein. Wiederholen Sie dies für jeden Zeitpunkt. Für alle Tiere, die am Ende des Tests nicht gelähmt sind, geben Sie eine “0” für 60 min ein. Führen Sie paarweise Vergleiche mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) in der statistischen Software (Table of Materials) durch, um festzustellen, ob ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen zwei verschiedenen Stämmen besteht. Für zusätzliche/alternative Analysen, anstatt Schritt 5.3 auszuführen. und Schritt 5.4., bestimmen Sie den Prozentsatz der Tiere, die sich zu jedem Zeitpunkt in jedem Brunnen bewegen. Zeichnen Sie den Mittelwert mit Standardfehler zu jedem Zeitpunkt für alle Stämme, die mit einem Tabellenkalkulationsprogramm oder der Statistiksoftware untersucht wurden (Abbildung 2C).