アセチルコリン受容体アゴニストレバミゾールに対する Caenorhabditisエレガン ス感受性の測定

1. レバミゾールアッセイ用プレートの調製 線虫増殖培地(NGM)培地を、攪拌子のあるフラスコ内で、3gのNaCl、2.5gのペプトン、および17gの寒天と1Lの脱イオン(DI)水とを組み合わせて調製する。 オートクレーブ処理後、70°Cに設定したホットプレートに培地を入れ、適度な速度で1時間攪拌する。 沈殿を防ぐために、1 mL の 5 mg/mL コレステロールを滴下し、1 mL の 1 mL の 1 M CaCl2、1 mL の 1 M MgSO4、および 25 mL の 1 M pH 6.0 リン酸カリウム緩衝液を培地に加えます。 2 mLのNGM培地を滅菌血清学的ピペットで24ウェルプレートの各ウェルに移します(図1)。 プレートをベンチトップで2日間乾燥させてから、細菌を播種します。長期間保管するには、4°Cに置きます。 消化液ブロス(LB)プレート上のOP50 大腸菌 をストリークアウトし、37°Cで一晩増殖させる。 単一のOP50コロニーをBブロス(1LのDIH2O中の10gのトリプトンおよび5gのNaCl)にピックし、培養振盪を37°Cで一晩設定した。 滅菌ピペットを使用して、OP50懸濁液30μLを各ウェルの中央の寒天上に滴下する(図1)。注:寒天の表面を傷つけないようにしてください、これはワームの穴を掘ることにつながります。 播種後少なくとも2日間、プレートを室温で放置して、細菌の芝生を形成させます。メモ:センターウェル内のバクテリアが2日経っても乾燥していない場合は、プレートをフード内で20分間開いたままにします(図1)。プレートを注ぎ、アッセイの1〜2週間前に細菌を播種する必要があります。 2. C.エレガンスの 同期(1日目) 野生型、unc-63(x26)、lev-10(x17)、およびunc-49(e407) C. elegansを6cmプレート上で成虫期まで成長させ、1株あたり少なくとも8枚のプレートを調製する。皿の上に飢えていないグラビッドな大人がたくさんいることを確認します。メモ: これは、必要なプレートの数の 2 倍です。しかし、卵の最初のバッチが漂白中に破壊された場合に備えて、バックアッププレートを持つことが重要です。 攪拌しながら 750 mL の DI 水に 59.6 g の Na2 HPO 4 (二塩基性)、29.9 g の KH 2 PO 4 (一塩基性)、12.8g の NaCl、および2.5g の MgSO4 を溶解して、10x M9 バッファーを作ります。溶解したら、容量を1 Lまで上げてろ過滅菌します。1:10とオートクレーブを希釈して、1x M9バッファーを作ります。注:1x M9バッファは、数週間または数ヶ月前に作成することができます。 同期の日にフードの下に漂白液を準備します。10 mL の漂白剤 (材料表)、2.5 mL の 10 N NaOH、および 37.5 mL の DI 水を 50 mL の円錐形チューブに混ぜます。ゴーグル、手袋、白衣は、漂白液で作業するときはいつでも着用してください。 プラスチック転写ピペットを使用して、少なくとも4つのプレートから1x M9バッファーで肉質の成虫を洗い流し、15mLの円錐形チューブに移します。 室温で1分間716 x g でスピンし、次いでトランスファーピペットを用いて上清を除去する。 漂白溶液10mLを加える。ワームの死骸のほとんど(すべてではない)が溶解するまで、チューブを反転させるか、または静かに約4分間振る(図1)。注:これは卵を破壊するので、ワームを過剰に漂白しないように注意してください。特定の突然変異は、卵の単離の困難さを高める可能性がある。 716 x g で1分間回転します。 漂白剤溶液を1つの動きで注ぎます。この時点でチューブが振られない限り、卵はチューブの側面にくっつきます。 15 mL の 1x M9 バッファーを加え、転倒させます。716 x g で1分間スピンし、M9バッファーを1回の滑らかな動きで注ぎます。 ステップ 2.9 で説明したように、1x M9 バッファーで合計 3 回の洗浄を実行します。 最終洗浄後、新鮮な1x M9を10mL加え、15°Cで一晩回転子の上に置き、飢餓に苦しんだ第1幼虫(L1)期動物の同期集団を単離する。メモ:回転子を装着する前に、M9バッファに卵があることを確認してください。そうでない場合は、バックアッププレートと漂白剤で準備を短時間で繰り返します。 3. メッキ同期C.エレガンス (2日目) 24 ウェル プレート マップを印刷し、ランダム化された場所にひずみを割り当てます。各株は、24ウェルプレートに少なくとも6回表されるべきである。 漂白剤調製の約24時間後、孵化した飢えたL1ワームを室温で1分間716 x g のM9バッファー中でスピンダウンさせた。 プラスチック転写ピペットで約9mLのM9緩衝液を除去し、次いで、飢えた第1幼虫期のワーム(L1s)を残りのM9緩衝液に穏やかに混合する。 直ちにM9バッファー中のワーム3μLを顕微鏡スライド上にピペットし、L1の数を決定する。必要な数は 3 μL で 20 ~ 30 L1s です。ワーム濃度が低すぎる場合はスピンダウンして M9 を除去し、濃度が高すぎる場合は M9 を追加します。メモ: 3 μL あたりのワームの数を少なくとも 2 倍に確認し、毎回チューブを反転させます。 予め作成されたプレートマップに従って、各ウェルにL1sのピペット3μL(合計20〜30ワーム)を(ステップ3. 図1)。注:M9のL1でチューブを頻繁に反転させて、ワームが底に落ち着くので均一な分布を維持します。これが行われないと、いくつかの井戸にはワームが少なすぎますが、他の井戸には多すぎます。また、ピペットの先端で寒天を突き刺さないでください。 ワームを20°Cで3日間成人期に成長させます。注:異なる成長温度と特定の突然変異の使用は成熟速度に影響を与える可能性があるため、 C. elegansの ライフサイクルを必ず考慮してください。 レバミゾールアッセイを行う(5日目) 空白のデータシートを印刷します。このデータシートを使用して、各ウェル内を移動するワームの数を 5 分ごとに 1 時間記録します。注:学生は5分ごとに最大12の井戸でワームを数えることができます。上位12ウェルは最初の1時間でアッセイされ、下部12ウェルはその後の1時間でアッセイされます。 24ウェルプレートのワームを確認してください。マーカーを使用して、プレートに「X」を蓋をして、汚染されている井戸、飢えている井戸、またはワームが多すぎる(>40)ため、数えにくくなります。 100 mM レバミゾールストック 200 μL を 1x M9 の 50 mL に添加して、0.4 mM レバミゾール溶液を作ります。240.76mgの塩酸レバミゾールを10mLのH2Oに溶解して100mMレバミゾールストックを調製し、−20°Cで保存する。注:レバミゾールはM9で希釈する必要があります。H2Oでの希釈は麻痺を促進する。生徒は手袋を着用するべきです。高濃度のレバミゾールの摂取は有毒である。 タイマーを開始し、トランスファーピペットを使用して、動物が自由に泳ぐことができるように、最初の2つのウェルに1mLの0.4mMレバミゾールを加えます。隣接するウェルにレバミゾールを加え続け、アッセイするウェルの数に応じて時間をずらす。注:例えば、10ウェルがアッセイされる場合、レバミゾールは、時間0のウェル1および2、1分後のウェル3および4、2分後のウェル5および6、3分後のウェル7および8、および4分後のウェル9および10の方法で添加される。 5 分で、最初のウェルから始めて、各ウェル内の移動するワームの数のみを手動でカウントし、その数をデータシートに記録します (図 1)。カウンターは使用できますが、移動するワームの数を正確に判断する必要はありません。注:多くのワームが麻痺する前に、早い時間帯に遅れをとることがあるため、学生はタイマーに注意する必要があります。時間点の数を調整することも、必要に応じて各時点でアッセイできるウェルの数を減らすこともできます。 各ウェル内の移動ワームの数を5分ごとに1時間カウントし続けます。注:M9に浸漬すると、この1時間のアッセイの過程で一定の水泳運動が誘導され、麻痺を評価するためにワームの突出が不要になります(図2A)。0.4mMレバミゾール溶液への曝露は、水泳の中止によって観察されるような時間依存性麻痺を誘発する。麻痺するワームは回復しません。 手順 4.4.-4.6 を繰り返します。プレート内の残りの井戸のために。 アッセイの終了時、または時間が許す限り、各ウェル内のワームの総数を記録します。 5. データ解析 プレートマップを取得し(ステップ3.1)、どのひずみが各ウェルに対応するかを記録します。注: 収集されるデータの量により、その後のデータの分析と議論には少なくとも数時間かかります。 データをスプレッドシートに入力し、各ウェル内のワームの総数から開始し、遺伝子型別に整理します。 ウェルからのデータを組み合わせて、各系統について各時点で移動するワームの数を決定する。 これらのデータを使用して、統計ソフトウェア(材料表)に「生存曲線」を作成し、集団の時間依存性麻痺を視覚的に表示します(図2B)。 左側の列に時間が表示され、後続の列に各ひずみのデータが含まれるようにデータ テーブルを作成します。最初の5分以内に麻痺した動物ごとに、行を作成し、5分間「1」を入力します。これを各時点について繰り返します。アッセイの終わりまでに麻痺しないすべての動物について、60分間「0」を入力します。 統計ソフトウェア(材料表)のログランク(Mantel-Cox)検定を使用してペアワイズ比較を実行し、2つの異なる系統間に統計的に有意な差があるかどうかを判断します。 追加/代替分析の場合、ステップ 5.3 を実行する代わりに。ステップ5.4と、各時点において各ウェル内を移動する動物の割合を決定する。スプレッドシートプログラムまたは統計ソフトウェアを使用してアッセイされたすべての株について、各時点での標準誤差で平均をプロットします(図2C)。