Medición de la sensibilidad de Caenorhabditis elegans al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol
Summary
El presente protocolo describe un ensayo para determinar la respuesta al levamisol, un agonista farmacológico de una clase de receptores de acetilcolina de Caenorhabditis elegans . En este ensayo de natación de levamisol líquido, los investigadores observan visualmente y cuantifican la parálisis dependiente del tiempo de los animales cultivados en placas de 24 pocillos.
Abstract
En la unión neuromuscular (NMJ), la unión del neurotransmisor excitatorio acetilcolina (ACh) a los receptores postsinápticos conduce a la contracción muscular. Al igual que en el músculo esquelético de los vertebrados, se requiere señalización colinérgica en los músculos de la pared corporal del organismo modelo Caenorhabditis elegans para la locomoción. La exposición al levamisol, un agonista farmacológico de una clase de receptores de ACh en los músculos de la pared del cuerpo, causa parálisis dependiente del tiempo de animales salvajes. La sensibilidad alterada al levamisol sugiere defectos en la señalización en la NMJ o en la función muscular. Aquí, se presenta un protocolo para un ensayo de levamisol líquido realizado en C. elegans cultivados en placas de 24 pocillos. La natación vigorosa de los animales en líquido permite la evaluación y cuantificación de la parálisis inducida por levamisol en cientos de gusanos durante un período de una hora sin requerir manipulación física. Este procedimiento se puede utilizar tanto con mutantes de tipo salvaje como con mutantes que tienen sensibilidad alterada al levamisol para demostrar las consecuencias funcionales de la señalización alterada en la NMJ.
Introduction
La activación de los receptores de acetilcolina postsinápticos (AChR) en el músculo esquelético da como resultado una señal eléctrica que conduce a la contracción muscular. La alteración de la función neuromuscular resulta en síndromes miasténicos y distrofias musculares en humanos 1,2,3,4. El nematodo Caenorhabditis elegans se ha utilizado ampliamente para aprender sobre los procesos biológicos fundamentales conservados evolutivamente y los mecanismos de la enfermedad. Los músculos esqueléticos de los vertebrados y los músculos de la pared corporal de C. elegans son funcionalmente equivalentes en el control de la locomoción5. Aquí, se presenta un ensayo simple que se puede usar para comparar C. elegans de tipo salvaje con mutantes que han alterado la señalización neuromuscular o la función muscular.
Las entradas excitatorias e inhibitorias recibidas de las neuronas motoras colinérgicas y GABAérgicas, respectivamente, hacen que los músculos de un lado del cuerpo de C. elegans se contraigan mientras que los músculos del otro lado se relajan, lo que permite la locomoción coordinada6. El levamisol, un agente antihelmíntico utilizado para tratar infecciones parasitarias por nematodos, se une y activa constitutivamente una clase de AChR en los músculos de la pared del cuerpo, lo que resulta en parálisis dependiente del tiempo7. Así, la sensibilidad alterada al levamisol puede ser utilizada para identificar C. elegans con defectos en el equilibrio de la señalización excitatoria e inhibitoria 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Por ejemplo, las mutaciones en subunidades del AChR sensible al levamisol (L-AChR), como UNC-63, así como el homólogo de C. elegans de Cubilin, LEV-10, que se requiere para la agrupación de L-AChR en la sinapsis, impactan la señalización excitatoria y dan como resultado resistencia al levamisol 7,8. Las mutaciones en el receptor GABAA UNC-49 reducen la señalización inhibitoria y causan hipersensibilidad al levamisol12.
La hipersensibilidad o resistencia al levamisol se ha evaluado tradicionalmente transfiriendo animales a placas de agar que contienen levamisol y luego pinchando regularmente los gusanos para determinar el punto de tiempo en el que ocurre la parálisis13,14,15. Hemos desarrollado un ensayo de natación de levamisol líquido que elimina la necesidad de manipulación física de los animales y permite la detección de cientos de animales en solo 1 h. Aquí, se describe el uso de este ensayo con animales de tipo salvaje, unc-63 (x26), lev-10 (x17) y unc-49 (e407). Sin embargo, este protocolo también se puede realizar en C. elegans expuestos a ARNi, como se hizo para validar los derribos identificados en una pantalla de ARNi de todo el genoma para la sensibilidad alterada al levamisol11.
Para este ensayo farmacológico, los gusanos se cultivaron hasta la edad adulta en placas de 24 pocillos, se agregaron levamisol 0,4 mM en tampón M9 a cada pocillo, y el número de animales en movimiento se registró cada 5 min durante 1 h. La parálisis inducida por levamisol se observó visualmente a lo largo del tiempo, y después de la finalización del ensayo, se cuantificaron los datos. La evaluación de mutantes junto con C. elegans de tipo salvaje permite a los estudiantes hacer predicciones sobre posibles efectos fenotípicos y luego realizar experimentos para probar sus hipótesis. En conclusión, este ensayo de levamisol líquido simple y económico es una forma ideal de demostrar el impacto de la pérdida de genes específicos en la función de NMJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
La respuesta alterada al levamisol puede identificar los genes necesarios para la señalización colinérgica postsináptica y la función muscular. El protocolo aquí describe un ensayo de levamisol líquido utilizado para cuantificar la parálisis dependiente del tiempo durante un período de tiempo de 1 hora. Los estudiantes hacen predicciones sobre los efectos de ciertas mutaciones genéticas, llevan a cabo un experimento con un gran tamaño de muestra y luego cuantifican sus resultados. Este ensayo es una forma simple y eficiente de cuantificar la parálisis inducida por levamisol sin recoger o pinchar animales, lo que lo hace adecuado para laboratorios de pregrado, así como para investigadores que estudian la transmisión neuromuscular. Aquí se discuten algunos de los escollos más comunes, las limitaciones del ensayo y una variación del protocolo que permite su uso con animales de derribo de ARNi; También se discute aquí cómo este ensayo se puede integrar en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.
La preparación adecuada de las placas de 24 pocillos es esencial. Primero, los céspedes bacterianos deben estar completamente secos antes de detectar animales L1 en los pozos. Si no se seca lo suficiente, la bacteria se mezcla con la solución de levamisol durante el ensayo, volviendo el líquido turbio y evitando que las personas puedan contar los gusanos. En segundo lugar, al sincronizar los gusanos a través de la preparación de lejía, los animales no deben estar expuestos a la solución de lejía durante demasiado tiempo, ya que esto hará que la capa protectora de los huevos se desintegre. En tercer lugar, es crucial detectar solo 20-30 L1 por pozo, ya que demasiados gusanos en los pozos hacen que sea extremadamente difícil contar con precisión el número que se mueve en el tiempo asignado. Finalmente, es importante mantener una técnica aséptica durante la preparación de las placas, ya que los pozos contaminados no se pueden ensayar.
Hay algunas limitaciones que deben considerarse al realizar este ensayo. Primero, contar el número de gusanos en movimiento en cada pozo cada 5 minutos puede ser abrumador para las personas que carecen de experiencia previa en laboratorio, y esto podría conducir a una recopilación de datos imprecisa. En cuanto a otros ensayos utilizados para determinar la sensibilidad a los medicamentos18,19, este experimento puede realizarse con menos puntos de tiempo. En segundo lugar, el recubrimiento de L1 hambrientos aislados de una preparación de lejía es un método fácil para obtener una población sincronizada; Sin embargo, se deben hacer ajustes si el tiempo de desarrollo difiere entre las cepas que se están analizando. Es posible recoger animales en fase larvaria tardía (L4) en una placa de 24 pocillos para este ensayo; Sin embargo, cuando se preparan muchos platos, esto requiere demasiado trabajo. Alternativamente, se debe determinar el tiempo que tarda cada cepa en alcanzar L4 y luego colocar las L1 en los pozos en diferentes momentos para ajustar las diferencias en la velocidad de maduración. Finalmente, si bien este ensayo puede usarse para identificar nuevos genes importantes para la función muscular postsináptica11, la respuesta alterada de levamisol también puede ser causada por mutación o knockdown de ARNi de genes presinápticos12. Si se observa una sensibilidad alterada al levamisol, se deben realizar experimentos adicionales para determinar la razón de este fenotipo.
Al hacer algunas modificaciones a las placas de 24 pocillos, el ensayo de natación de levamisol descrito también se puede realizar en animales de derribo de ARNi11. La eliminación del gen a través de RNAi se puede lograr alimentando bacterias C. elegans que expresan ARN bicatenario correspondiente al gen de interés20. Para la preparación de placas de RNAi, se debe agregar 1 mL de 1M IPTG y 1 mL de 25 mg/mL de carbenicilina por litro de medio después de retirarlo del autoclave. Los cultivos bacterianos se cultivan recogiendo una sola colonia en 3 ml de caldo LB más 3 μL de 25 mg / ml de carbenicillin, y agitando a 37 ° C durante la noche, y el mapa de placas se realiza cuando se detectan las diferentes bacterias en los pocillos. C. elegans se sincronizan mediante la preparación de lejía como se describe; sin embargo, se debe usar la cepa eri-1 hipersensible de ARNi (mg366) en lugar del tipo salvaje para aumentar la eliminación del gen. Las caídas de ARNi resultan en los mismos fenotipos de levamisol observados para los mutantes de pérdida de función11.
El protocolo presentado aquí se puede utilizar en la investigación de laboratorio, como un experimento independiente en el laboratorio de pregrado, o en las primeras semanas de un curso avanzado de pregrado como una introducción a las técnicas básicas de C. elegans y la función neuromuscular. En un curso más avanzado basado en el descubrimiento, los estudiantes pueden usar este ensayo para determinar si la pérdida de C. elegans homólogos de genes mutados en individuos con síndromes miasténicos, distrofias musculares o miopatías alteran la sensibilidad al levamisol. En conclusión, este ensayo de sensibilidad de levamisol simple y económico proporciona un enfoque práctico para aprender sobre la señalización en el NMJ y adquirir experiencia trabajando con el sistema modelo de C. elegans.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Riya Dattani y Lauren Hogstrom, quienes recopilaron los datos en la Figura 2B, C ciego al genotipo en el Laboratorio de Genética Avanzada BISC413 (primavera de 2022) en la Universidad de Delaware. Información adicional sobre la experiencia de investigación de pregrado basada en el curso BISC413 (CURE), así como el acceso al manual de laboratorio diseñado por J. Tanis, está disponible a pedido. Las cepas de nematodos fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis , que cuenta con el apoyo del NIH-ORIP (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por un P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (a J.E.T.).
Materials
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
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