Mesure de la sensibilité de Caenorhabditis elegans au levamisole agoniste des récepteurs de l’acétylcholine

1. Préparation des plaques pour le dosage du lévamisole Préparer le milieu de croissance des nématodes (NGM) en combinant 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone et 17 g de gélose avec 1 L d’eau désionisée (DI) dans une fiole munie d’une barre d’agitation. Après l’autoclavage, placer le média sur une plaque chauffante réglée à 70 °C et agiter à vitesse modérée pendant 1 h. Ajouter 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol goutte à goutte pour prévenir la précipitation, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4 et 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M pH 6,0 dans le milieu. Transférer 2 mL de milieu NGM dans chaque puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pipette sérologique stérile (Figure 1). Laissez les assiettes sécher sur la paillasse pendant 2 jours avant de semer avec des bactéries. Pour un stockage à plus long terme, placez-les à 4 °C. Étaler OP50 E. coli sur une plaque de bouillon de lysogénie (LB) et pousser pendant la nuit à 37 °C. Prélever une seule colonie d’OP50 dans un bouillon B (10 g de tryptone et 5 g de NaCl dans 1 L de DIH2O) et mettre la culture en agitation à 37 °C pendant la nuit. À l’aide d’une pipette stérile, déposer 30 μL de suspension d’OP50 sur la gélose au milieu de chaque puits (figure 1).REMARQUE: Assurez-vous de ne pas endommager la surface de la gélose car cela entraînerait un enfouissement de vers. Laissez les assiettes reposer à température ambiante pendant au moins 2 jours après l’ensemencement pour permettre la formation d’une pelouse bactérienne.REMARQUE : Si les bactéries dans les puits centraux ne sont pas sèches après 2 jours, laissez les plaques ouvertes dans la hotte pendant 20 minutes (Figure 1). Les plaques doivent être versées et ensemencées avec des bactéries 1-2 semaines avant le test. 2. Synchronisation de C. elegans (jour 1) Cultiver des C. elegans de type sauvage, unc-63(x26), lev-10(x17) et unc-49(e407) jusqu’à l’âge adulte sur des plaques de 6 cm, en préparant au moins huit plaques par souche. Confirmez qu’il y a beaucoup d’adultes gravides non affamés dans les assiettes.REMARQUE: C’est deux fois plus de plaques que nécessaire; Cependant, il est important d’avoir des plaques de secours au cas où le premier lot d’œufs serait détruit pendant le blanchiment. Faire 10x tampon M9 en dissolvant 59,6 g de Na 2 HPO 4 (dibasique), 29,9 g de KH 2 PO 4 (monobasique), 12,8 g de NaCl et2,5g de MgSO4 dans 750 mL d’eau DI sous agitation. Une fois dissous, porter le volume à 1 L et filtrer stériliser. Diluer 1:10 et autoclave pour faire 1x tampon M9.REMARQUE: Le tampon M9 1x peut être fabriqué des semaines ou des mois à l’avance. Préparer la solution de blanchiment sous le capot le jour de la synchronisation. Mélanger 10 mL d’eau de Javel (Table des matières), 2,5 mL de NaOH 10 N et 37,5 mL d’eau DI dans un tube conique de 50 mL. Portez des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire chaque fois que vous travaillez avec la solution de blanchiment. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, laver les vers adultes gravides d’au moins quatre plaques avec 1x tampon M9 et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Faire tourner à 716 x g pendant 1 min à température ambiante, puis retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de transfert. Ajouter 10 mL de la solution de blanchiment. Retourner ou agiter doucement le tube pendant ~4 minutes jusqu’à ce que la plupart, mais pas toutes, des carcasses de vers se soient dissoutes (figure 1).REMARQUE: Veillez à ne pas trop blanchir les vers car cela détruirait les œufs. Certaines mutations peuvent augmenter la difficulté de l’isolement des ovules. Faire tourner à 716 x g pendant 1 min. Verser la solution d’eau de Javel en un seul mouvement; Tant que le tube n’est pas secoué à ce stade, les œufs colleront sur le côté du tube. Ajouter 15 mL de 1x tampon M9 et inverser. Faites tourner à 716 x g pendant 1 min et versez le tampon M9 en un seul mouvement fluide. Effectuez trois lavages au total avec 1x tampon M9, comme décrit à l’étape 2.9. Après le lavage final, ajouter 10 ml de 1x M9 frais et placer sur un rotateur pendant la nuit à 15 °C pour isoler une population synchronisée d’animaux affamés au stade larvaire (L1).REMARQUE: Avant de placer sur le rotateur, vérifiez qu’il y a des œufs dans le tampon M9. Sinon, répétez la préparation avec des plaques de secours et de l’eau de Javel pendant une période plus courte. 3. Placage synchronisé de C. elegans (jour 2) Imprimez une carte de plaque de 24 puits et attribuez des souches à des endroits aléatoires. Chaque souche doit être représentée dans la plaque de 24 puits au moins six fois. Environ 24 h après la préparation de l’eau de Javel, faire tourner les vers L1 affamés éclos dans un tampon M9 à 716 x g pendant 1 min à température ambiante. Retirer ~9 ml de tampon M9 avec une pipette de transfert en plastique, puis mélanger délicatement les premiers vers larvaires affamés (L1) dans le tampon M9 restant. Pipeter immédiatement 3 μL des vers dans le tampon M9 sur une lame de microscope et déterminer le nombre de L1; le nombre souhaité est de 20-30 L1s dans 3 μL. Faites tourner vers le bas et retirez M9 si la concentration du ver est trop faible, et ajoutez M9 si la concentration est trop élevée.REMARQUE: Vérifiez le nombre de vers par 3 μL au moins 2x, en inversant le tube à chaque fois. Pipet 3 μL de L1 (20-30 vers au total) dans chaque puits selon la carte de plaque préfabriquée (étape 3.1; Graphique 1).REMARQUE: Inversez fréquemment le tube avec les L1 dans M9 pour maintenir une répartition uniforme des vers car ils se déposeront au fond. Si cela n’est pas fait, certains puits auront trop peu de vers, tandis que d’autres en auront trop. De plus, ne percez pas la gélose avec l’embout de la pipette, car cela enfouirait les animaux. Laissez les vers grandir jusqu’à l’âge adulte pendant 3 jours à 20 °C.REMARQUE: L’utilisation de différentes températures de croissance et de certaines mutations peut avoir un impact sur la vitesse de maturation, alors assurez-vous de considérer le cycle de vie de C. elegans. 4. Réalisation du dosage du lévamisole (jour 5) Imprimez une fiche technique vierge, qui sera utilisée pour enregistrer le nombre de vers se déplaçant dans chaque puits toutes les 5 minutes pendant 1 h.NOTE: Les élèves pourront compter les vers dans au plus 12 puits toutes les 5 minutes. Les 12 premiers puits sont analysés au cours de la première heure, et les 12 derniers puits sont analysés dans l’heure suivante. Vérifiez les vers dans les plaques de 24 puits. À l’aide d’un marqueur, placez un « X » sur le couvercle de la plaque au-dessus de tous les puits contaminés, affamés ou trop nombreux vers (>40), ce qui rendra le comptage difficile. Préparer une solution de lévamisole 0,4 mM en ajoutant 200 μL de bouillon de lévamisole de 100 mM à 50 mL de 1x M9. Préparer un stock de lévamisole de 100 mM en dissolvant 240,76 mg de chlorhydrate de lévamisole dans 10 mL deH2Oet le conserver à −20 °C.NOTE: Le lévamisole doit être dilué dans M9; la dilution dansH2Oaccélère la paralysie. Les élèves doivent porter des gants. L’ingestion de fortes concentrations de lévamisole est toxique. Démarrez une minuterie puis, à l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez 1 mL de lévamisole 0,4 mM aux deux premiers puits, de sorte que les animaux nagent librement. Continuez à ajouter du lévamisole aux puits adjacents, en échelonnant le temps en fonction du nombre de puits à analyser.NOTE: Par exemple, si 10 puits sont analysés, le lévamisole sera ajouté de la manière suivante: puits 1 et 2 au temps 0, puits 3 et 4 après 1 min, puits 5 et 6 après 2 min, puits 7 et 8 après 3 min, et puits 9 et 10 après 4 min. À 5 min, commencez à compter manuellement uniquement le nombre de vers en mouvement dans chaque puits, en commençant par le premier puits, et notez ce nombre sur la fiche technique (Figure 1). Les compteurs peuvent être utilisés mais ne sont pas nécessaires pour déterminer avec précision le nombre de vers en mouvement.REMARQUE: Les élèves doivent garder un œil sur la minuterie car ils prendront parfois du retard pendant les premiers moments avant que de nombreux vers ne paralysent. Le nombre de points temporels peut être ajusté, ou moins de puits peuvent être analysés à chaque point temporel si nécessaire. Continuez à compter le nombre de vers en mouvement dans chaque puits toutes les 5 minutes pendant 1 h.REMARQUE : L’immersion dans M9 induit un mouvement de nage constant au cours de ce test de 1 h, ce qui élimine le besoin d’aiguillonner les vers pour évaluer la paralysie (Figure 2A). L’exposition à une solution de lévamisole à 0,4 mM induit une paralysie dépendante du temps observée par l’arrêt de la natation ; Les vers qui paralysent ne se rétablissent pas. Répétez les étapes 4.4.-4.6. pour le reste des puits dans l’assiette. À la fin de l’essai, ou lorsque le temps le permet, notez le nombre total de vers dans chaque puits. 5. Analyse des données Obtenez la carte des plaques (étape 3.1.) et notez quelle déformation correspond à chaque puits.REMARQUE : En raison de la quantité de données recueillies, l’analyse et la discussion subséquentes des données prendront au moins quelques heures. Entrez les données dans une feuille de calcul, en commençant par le nombre total de vers dans chaque puits et en les organisant par génotype. En combinant les données des puits, déterminez le nombre de vers se déplaçant à chaque point temporel pour chaque souche. Utilisez ces données pour créer une « courbe de survie » dans le logiciel statistique (Table of Materials) afin d’afficher visuellement la paralysie de la population dépendante du temps (Figure 2B). Créez un tableau de données de sorte que la colonne de gauche indique l’heure et que les colonnes suivantes contiennent les données pour chaque souche. Pour chaque animal paralysé au cours des 5 premières minutes, créez une ligne et entrez un « 1 » pendant 5 minutes. Répétez cette opération pour chaque point temporel. Pour tous les animaux qui ne paralysent pas à la fin de l’essai, entrez un « 0 » pendant 60 minutes. Effectuer des comparaisons par paires à l’aide du test de log-rank (Mantel-Cox) dans le logiciel statistique (Table of Materials) pour déterminer s’il existe une différence statistiquement significative entre deux souches différentes. Pour une analyse supplémentaire/alternative, au lieu d’effectuer l’étape 5.3. et l’étape 5.4., déterminer le pourcentage d’animaux se déplaçant dans chaque puits à chaque point temporel. Tracer la moyenne avec l’erreur-type à chaque point temporel pour toutes les souches analysées à l’aide d’un tableur ou d’un logiciel statistique (figure 2C).