Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

1. Bereiding van platen voor de levamisoltest Bereid nematodengroeimedium (NGM) media door 3 g NaCl, 2,5 g pepton en 17 g agar te combineren met 1 l gedeïoniseerd (DI) water in een kolf met een roerstaaf. Leg na het autoclaveren de media op een hete plaat op 70 °C en roer gedurende 1 uur met een gematigde snelheid. Voeg 1 ml 5 mg / ml cholesterol druppelsgewijs toe om neerslag te voorkomen, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 en 25 ml 1 M pH 6,0 kaliumfosfaatbuffer aan de media. Breng 2 ml NGM-media over in elke put van een 24-wellsplaat met een steriele serologische pipet (figuur 1). Laat de platen 2 dagen drogen op de benchtop voordat je ze inzaait met bacteriën. Voor langere opslag, plaats ze op 4 °C. Strooi OP50 E. coli uit op een lysogeny bouillon (LB) plaat en groei ‘s nachts bij 37 °C. Kies een enkele OP50-kolonie in B-bouillon (10 g trypton en 5 g NaCl in 1 L DI H2O) en zet de cultuur ‘s nachts op 37 °C. Laat met behulp van een steriele pipet 30 μL OP50-suspensie op de agar in het midden van elke put vallen (figuur 1).OPMERKING: Zorg ervoor dat u het agaroppervlak niet beschadigt, omdat dit zal leiden tot het graven van wormen. Laat de platen na het zaaien minstens 2 dagen op kamertemperatuur staan om een bacterieel gazon te laten ontstaan.OPMERKING: Als de bacteriën in de middelste putten na 2 dagen niet droog zijn, laat de platen dan 20 minuten open in de kap (figuur 1). De platen moeten 1-2 weken voor de test worden gegoten en bezaaid met bacteriën. 2. Synchroniseren van C. elegans (dag 1) Kweek wild-type, unc-63(x26), lev-10(x17), en unc-49(e407) C. elegans tot volwassenheid op platen van 6 cm, waarbij ten minste acht platen per stam worden bereid. Bevestig dat er veel niet-uitgehongerde gravid volwassenen op de borden staan.OPMERKING: Dit is twee keer zoveel platen als nodig is; het is echter belangrijk om back-upplaten te hebben voor het geval de eerste partij eieren tijdens het bleken wordt vernietigd. Maak 10x M9 buffer door 59,6 g Na2HPO4 (dibasisch), 29,9 g KH2PO4 (monobasisch), 12,8 g NaCl en 2,5 g MgSO4 in 750 ml DI-water met roeren op te lossen. Eenmaal opgelost, breng het volume op 1 L en filter steriliseer. Verdun 1:10 en autoclaaf om 1x M9 buffer te maken.LET OP: De 1x M9 buffer kan weken of maanden van tevoren gemaakt worden. Bereid bleekoplossing onder de motorkap voor op de dag van synchronisatie. Meng 10 ml bleekmiddel (tabel met materialen), 2,5 ml 10 N NaOH en 37,5 ml DI-water in een conische buis van 50 ml. Draag een bril, handschoenen en een laboratoriumjas wanneer u met de bleekoplossing werkt. Was met behulp van een plastic transferpipet gravid volwassen wormen van ten minste vier platen met 1x M9-buffer en breng ze over in een conische buis van 15 ml. Draai op 716 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het supernatant met behulp van een transferpipet. Voeg 10 ml van de bleekoplossing toe. Keer de buis om of schud voorzichtig gedurende ~ 4 minuten totdat de meeste, maar niet alle, van de wormkarkassen zijn opgelost (figuur 1).OPMERKING: Pas op dat u de wormen niet te veel bleekt, omdat dit de eieren zal vernietigen. Bepaalde mutaties kunnen de moeilijkheid van ei-isolatie verhogen. Draai op 716 x g gedurende 1 min. Giet de bleekoplossing in één beweging af; zolang de buis op dit punt niet wordt geschud, blijven de eieren aan de zijkant van de buis plakken. Voeg 15 ml 1x M9 buffer toe en keer om. Draai op 716 x g gedurende 1 min en giet de M9-buffer in één vloeiende beweging af. Voer in totaal drie wasbeurten uit met 1x M9 buffer, zoals beschreven in stap 2.9. Voeg na de laatste wasbeurt 10 ml verse 1x M9 toe en plaats deze een nacht op een rotator bij 15 °C om een gesynchroniseerde populatie uitgehongerde eerste larvale (L1) stadiumdieren te isoleren.OPMERKING: Controleer voordat u de rotator plaatst of er eieren in de M9-buffer zitten. Zo niet, herhaal dan de voorbereiding met reserveplaten en bleekmiddel voor een kortere tijd. 3. Plating gesynchroniseerde C. elegans (dag 2) Print een plaatkaart met 24 putten uit en wijs stammen toe aan gerandomiseerde plaatsen. Elke stam moet minstens zes keer in de 24-wellsplaat worden weergegeven. Ongeveer 24 uur na de bleekvoorbereiding, spin-down uitgehongerde L1-wormen in M9-buffer bij 716 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verwijder ~ 9 ml M9-buffer met een plastic transferpipet en meng vervolgens voorzichtig de uitgehongerde wormen in het eerste larvale stadium (L1’s) in de resterende M9-buffer. Pipetteer onmiddellijk 3 μL van de wormen in M9-buffer op een microscoopglaasje en bepaal het aantal L1’s; het gewenste aantal is 20-30 L1s in 3 μL. Draai af en verwijder M9 als de wormconcentratie te laag is en voeg M9 toe als de concentratie te hoog is.OPMERKING: Controleer het aantal wormen per 3 μL ten minste 2x, waarbij u de buis elke keer omkeert. Pipetteer 3 μL L1s (20-30 wormen totaal) in elke put volgens de vooraf gemaakte plaatkaart (stap 3.1; Figuur 1).OPMERKING: Keer de buis regelmatig om met de L1’s in M9 om een gelijkmatige verdeling van wormen te behouden, omdat ze naar de bodem zullen zakken. Als dit niet gebeurt, zullen sommige putten te weinig wormen hebben, terwijl anderen er te veel zullen hebben. Doorbaar de agar ook niet met de pipetpunt, omdat dit ervoor zorgt dat de dieren zich ingraven. Laat de wormen 3 dagen bij 20 °C uitgroeien tot volwassenheid.OPMERKING: Het gebruik van verschillende groeitemperaturen en bepaalde mutaties kan de rijpingssnelheid beïnvloeden, dus houd rekening met de levenscyclus van C. elegans . 4. Uitvoeren van de levamisoltest (dag 5) Druk een lege datasheet af, die wordt gebruikt om het aantal wormen te registreren dat elke 5 minuten gedurende 1 uur in elke put beweegt.OPMERKING: Studenten kunnen de wormen in maximaal 12 putten per 5 minuten tellen. De bovenste 12 putten worden in het eerste uur getest, terwijl de onderste 12 putten in het volgende uur worden getest. Controleer de wormen in de 24-well platen. Maak met behulp van een marker een “X” op het plaatdeksel over putten die besmet zijn, uitgehongerd zijn of te veel wormen hebben (>40), wat het tellen moeilijk zal maken. Maak 0,4 mM levamisoloplossing door 200 μL 100 mM levamisolvoorraad toe te voegen aan 50 ml 1x M9. Bereid 100 mM levamisolvoorraad door 240,76 mg levamisolhydrochloride op te lossen in 10 ml H2O en bewaar het bij −20 °C.OPMERKING: Levamisol moet worden verdund in M9; verdunning in H2O versnelt de verlamming. Studenten moeten handschoenen dragen. Inname van hoge concentraties levamisol is toxisch. Start een timer en voeg vervolgens met behulp van een transferpipet 1 ml 0,4 mM levamisol toe aan de eerste twee putten, zodat de dieren vrij zwemmen. Blijf levamisol toevoegen aan de aangrenzende putten en spreid de tijd op basis van het aantal te testen putten.OPMERKING: Als bijvoorbeeld 10 putten worden getest, wordt levamisol op de volgende manier toegevoegd: putten 1 en 2 op tijdstip 0, putten 3 en 4 na 1 min, putten 5 en 6 na 2 min, putten 7 en 8 na 3 min en putten 9 en 10 na 4 min. Begin na 5 minuten handmatig alleen het aantal bewegende wormen in elke put te tellen, te beginnen met de eerste put, en noteer dat aantal op de datasheet (figuur 1). Tellers kunnen worden gebruikt, maar zijn niet vereist om het aantal bewegende wormen nauwkeurig te bepalen.OPMERKING: Studenten moeten de timer in de gaten houden, omdat ze soms achterop raken tijdens vroege tijdspunten voordat veel wormen verlammen. Het aantal tijdspunten kan worden aangepast, of indien nodig kunnen er op elk tijdstip minder putten worden getest. Blijf het aantal bewegende wormen in elke put elke 5 min gedurende 1 uur tellen.OPMERKING: Onderdompeling in M9 induceert constante zwembeweging in de loop van deze 1 uur-test, waardoor het niet nodig is om de wormen te porren om verlamming te beoordelen (figuur 2A). Blootstelling aan 0,4 mM levamisoloplossing induceert tijdsafhankelijke verlamming zoals waargenomen door stoppen met zwemmen; wormen die verlammen, herstellen niet. Herhaal stap 4.4.-4.6. voor de rest van de putten in de plaat. Noteer aan het einde van de test, of wanneer de tijd het toelaat, het totale aantal wormen in elke put. 5. Data-analyse Verkrijg de plaatkaart (stap 3.1.) en noteer welke stam overeenkomt met elke put.OPMERKING: Vanwege de hoeveelheid verzamelde gegevens duurt de daaropvolgende analyse en bespreking van de gegevens minstens een paar uur. Voer de gegevens in een spreadsheet in, te beginnen met het totale aantal wormen in elke put en genotype. Door gegevens uit de putten te combineren, bepaalt u het aantal wormen dat op elk tijdstip voor elke stam beweegt. Gebruik deze gegevens om een “overlevingscurve” te creëren in de statistische software (Tabel van Materialen) om de tijdsafhankelijke verlamming van de populatie visueel weer te geven (figuur 2B). Maak een gegevenstabel zodat de linkerkolom de tijd aangeeft en de volgende kolommen de gegevens voor elke stam bevatten. Voor elk dier dat binnen de eerste 5 minuten verlamd is, maakt u een rij en voert u gedurende 5 minuten een “1” in. Herhaal dit voor elk tijdstip. Voor alle dieren die aan het einde van de test niet verlammen, voert u gedurende 60 minuten een “0” in. Voer paarsgewijze vergelijkingen uit met behulp van de log-rank (Mantel-Cox) -test in de statistische software (Table of Materials) om te bepalen of er een statistisch significant verschil is tussen twee verschillende stammen. Voor aanvullende/alternatieve analyse, in plaats van stap 5.3 uit te voeren. en stap 5.4., bepaal het percentage dieren dat op elk tijdstip in elke put beweegt. Plot het gemiddelde met standaardfout op elk tijdstip voor alle stammen die zijn getest met behulp van een spreadsheetprogramma of de statistische software (figuur 2C).