Studiare i driver dell'antiricompensa nel comportamento di dipendenza con metodi di espressione genica anatomicamente specifici a singola cellula

La dipendenza rimane una sfida crescente nel mondo sviluppato ^1,2. Nonostante i grandi progressi scientifici e clinici, i tassi di dipendenza continuano ad aumentare mentre l’efficacia dei trattamenti consolidati rimane stabile nel migliore dei casi ^3,4,5. Tuttavia, i progressi nella biotecnologia e negli approcci scientifici hanno portato a nuovi metodi e ipotesi per indagare ulteriormente la fisiopatologia della dipendenza da sostanze ^6,7,8. In effetti, i recenti sviluppi suggeriscono che nuovi concetti e paradigmi di trattamento possono portare a scoperte con conseguenze sociali, economiche e politiche 9,10,11,12.

Abbiamo studiato l’antiricompensa nella sospensione della dipendenza da alcol e oppioidi^13,14,15,16. I metodi sono centrali in questo paradigma^17,18. La microdissezione a cattura laser (LCM) può selezionare singole cellule con elevata specificità anatomica. Questa funzionalità è parte integrante dell’ipotesi dell’antiricompensa della neuroinfiammazione in quanto sia la glia che i neuroni possono essere raccolti e analizzati dallo stesso sottonucleo neuronale nello stesso animale 13,14,15,16,19. Una porzione rilevante del trascrittoma di cellule selezionate può quindi essere misurata con reazioni a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR) fornendo set di dati ad alta dimensione per l’analisi computazionale che fornisce approfondimenti sulle reti funzionali^20,21.

La misurazione di un sottoinsieme del trascrittoma nei neuroni e nella glia in uno specifico nucleo cerebrale genera un set di dati che è robusto sia nel numero di campioni che nei geni misurati ed è sensibile e specifico. Questi strumenti sono ottimali per l’approccio neuroscientifico di un sistema alle malattie psichiatriche perché la glia, principalmente astrociti e microglia, ha dimostrato un ruolo centrale nelle malattie neurologiche e psichiatriche negli ultimi dieci anni^22,23. Il nostro approccio può misurare la risposta espressiva di glia e neuroni in concomitanza attraverso numerosi recettori e ligandi coinvolti nella segnalazione paracrina locale. In effetti, la segnalazione può essere dedotta da questi set di dati utilizzando vari metodi quantitativi come la logica fuzzy²⁴. Inoltre, l’identificazione dei sottofenotipi cellulari nei neuroni o nella glia e la loro funzione può fornire informazioni su come le cellule cerebrali in nuclei specifici organizzano, rispondono e disregolano a livello di singola cellula. La dinamica di questo sistema funzionale può anche essere modellata con esperimenti di serie temporali¹⁶. Infine, i modelli animali possono essere perturbati anatomicamente o farmacologicamente per dare una condizione meccanicistica all’approccio di questo sistema.

Esperimento rappresentativo:
Di seguito, forniamo un esempio dell’applicazione di questi metodi. Questo studio ha studiato l’espressione genica neuronale e microglia del ratto nel nucleo solitario (NTS) in risposta alla dipendenza da alcol e alla successiva sospensione¹⁶. Le coorti di ratti comprendevano 1) Controllo, 2) Etanolo-dipendente (EtOH), 3) 8 ore di prelievo (Wd), 4) 32 ore Wd e 5) 176 h Wd (Figura 1A). Dopo una rapida decapitazione, i tronchi cerebrali sono stati separati dal proencefalo e criosezionati, e le fette sono state colorate per i neuroni e la microglia positivi alla tirosina idrossilasi (TH +) (Figura 1B). LCM è stato utilizzato per raccogliere sia i neuroni TH+ che TH- e la microglia. Tutte le cellule provenivano dall’NTS e analizzate come campioni di pool di 10 cellule. Quattro array dinamici microfluidici RT-qPCR 96 x 96 sono stati eseguiti sulla piattaforma RT-qPCR che misura 65 geni (Figura 1B-C). I dati sono stati normalizzati utilizzando un metodo -ΔΔC_t e analizzati utilizzando R, e la selezione di singole cellule è stata convalidata con marcatori molecolari (Figura 1D-E). La convalida tecnica è stata ulteriormente verificata da repliche tecniche analizzate all’interno di un singolo lotto e tra lotti (Figura 2 e Figura 3). Neuroni TH+ e TH- organizzati in diversi sottofenotipi con cluster di geni infiammatori simili ma diversi cluster del recettore (R) dell’acido γ-aminobutirrico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). I sottofenotipi che avevano un’elevata espressione di cluster genici infiammatori erano sovrarappresentati a 32 h Wd mentre l’espressione del recettore GABA (GABAR) è rimasta bassa nell’astinenza prolungata da alcol (176 h Wd). Questo lavoro contribuisce all’ipotesi antiricompensa della dipendenza da alcol e oppioidi che ipotizza che il feedback intercettivo dai visceri in astinenza contribuisca alla disregolazione dei nuclei neuronali viscerali-emotivi (cioè NTS e amigdala) con conseguente sequele autonomiche ed emotive più gravi, che contribuiscono alla dipendenza da sostanze (Figura 6).