Investigando Drivers de Anti-recompensa no Comportamento de Dependência com Métodos de Expressão Gênica de Célula Única Anatomicamente Específicos

O vício continua sendo um desafio crescente no mundo desenvolvido ^1,2. Apesar dos grandes avanços científicos e clínicos, as taxas de dependência continuam a aumentar, enquanto a eficácia dos tratamentos estabelecidos permanece estável na melhor das hipóteses ^3,4,5. No entanto, os avanços na biotecnologia e nas abordagens científicas têm levado a novos métodos e hipóteses para investigar melhor a fisiopatologia da dependência de substâncias ^6,7,8. De fato, desenvolvimentos recentes sugerem que novos conceitos e paradigmas de tratamento podem levar a avanços com consequências sociais, econômicas e políticas 9,10,11,12.

Investigamos o anti-recompensa na abstinência da dependência de álcool e opioides^13,14,15,16. Os métodos são centrais para esse paradigma^17,18. A microdissecção por captura a laser (LCM) pode selecionar células individuais com alta especificidade anatômica. Essa funcionalidade é parte integrante da hipótese anti-recompensa da neuroinflamação, pois tanto a glia quanto os neurônios podem ser coletados e analisados a partir do mesmo subnúcleo neuronal no mesmo animal 13,14,15,16,19. Uma porção relevante do transcriptoma de células selecionadas pode então ser medida com reações quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR), fornecendo conjuntos de dados de alta dimensão para análise computacional, fornecendo insights sobre redes funcionais^20,21.

Medir um subconjunto do transcriptoma em neurônios e glia em um núcleo cerebral específico gera um conjunto de dados que é robusto tanto no número de amostras quanto nos genes medidos e é sensível e específico. Essas ferramentas são ótimas para a abordagem da neurociência de um sistema para doenças psiquiátricas, pois a glia, principalmente astrócitos e micróglias, demonstraram um papel central na doença neurológica e psiquiátrica na última década^22,23. Nossa abordagem pode medir a resposta expressiva da glia e dos neurônios concomitantemente em vários receptores e ligantes envolvidos na sinalização parácrina local. De fato, a sinalização pode ser inferida a partir desses conjuntos de dados usando vários métodos quantitativos, como a lógica fuzzy²⁴. Além disso, a identificação de subfenótipos celulares em neurônios ou glia e sua função pode fornecer informações sobre como as células cerebrais em núcleos específicos organizam, respondem e desregulam no nível de célula única. A dinâmica desse sistema funcional também pode ser modelada com experimentos de séries^{temporais 16}. Por fim, os modelos animais podem ser perturbados anatomicamente ou farmacologicamente para emprestar uma condição mecanicista à abordagem desse sistema.

Experiência representativa:
Abaixo, fornecemos um exemplo da aplicação desses métodos. Este estudo investigou a expressão gênica neuronal e microglia de ratos no núcleo solitário (SNT) em resposta à dependência de álcool e subsequente abstinência¹⁶. As coortes de ratos compreenderam 1) Controle, 2) Etanol-dependente (EtOH), 3) Retirada de 8 h (Wd), 4) Wd de 32 h e 5) Wd de 176 h (Figura 1A). Após a rápida decapitação, os caules cerebrais foram separados do prosencéfalo e criosseccionados, e fatias foram coradas para neurônios e micróglia positivos para tirosina hidroxilase (TH +) (Figura 1B). O LCM foi usado para coletar neurônios TH+ e TH- e microglia. Todas as células eram do NTS e analisadas como amostras de pools de 10 células. Quatro matrizes dinâmicas microfluídicas RT-qPCR de 96 x 96 foram executadas na plataforma RT-qPCR medindo 65 genes (Figura 1B-C). Os dados foram normalizados pelo método -ΔΔC_t e analisados por R, e a seleção unicelular foi validada com marcadores moleculares (Figura 1D-E). A validação técnica foi ainda verificada por meio de repetições técnicas analisadas dentro de um único lote e entre lotes (Figura 2 e Figura 3). Neurônios TH+ e TH- organizados em diferentes subfenótipos com clusters de genes inflamatórios semelhantes, mas diferentes clusters de receptores (R) de ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). Os subfenótipos que apresentaram expressão elevada de clusters de genes inflamatórios foram super-representados em 32 h Wd, enquanto a expressão do receptor GABA (GABAR) permaneceu baixa na abstinência prolongada de álcool (176 h Wd). Este trabalho contribui para a hipótese antirecompensa da dependência de álcool e opioides, que conjectura que o feedback interceptivo das vísceras na abstinência contribui para a desregulação dos núcleos neuronais visceral-emocionais (ou seja, NTS e amígdala), resultando em sequelas autonômicas e emocionais mais graves, que contribuem para a dependência de substâncias (Figura 6).