Исследование факторов антиревардии в аддиктивном поведении с помощью анатомически специфических методов экспрессии одноклеточных генов

Наркомания остается растущей проблемой в развитом мире ^1,2. Несмотря на значительные научные и клинические достижения, показатели наркомании продолжают расти, в то время как эффективность установленных методов лечения остается стабильной в лучшем случае ^3,4,5. Однако достижения в области биотехнологии и научных подходов привели к появлению новых методов и гипотез для дальнейшего исследования патофизиологии зависимости от вещества ^6,7,8. Действительно, последние события свидетельствуют о том, что новые концепции и парадигмы лечения могут привести к прорывам с социальными, экономическими и политическими последствиями ^9,10,11,12.

Мы исследовали антиревардию при отмене алкогольной и опиоидной зависимости 13,14,15,16. Методы занимают центральное место в этой ^{парадигме 17,18}. Микродиссекция лазерного захвата (LCM) может отбирать отдельные клетки с высокой анатомической специфичностью. Эта функциональность является неотъемлемой частью антиреактивной гипотезы нейровоспаления, поскольку и глия, и нейроны могут быть собраны и проанализированы из одного и того же нейронального субядра у одного и того же животного 13,14,15,16,19. Соответствующая часть транскриптома выбранных клеток затем может быть измерена с помощью высокопроизводительных микрофлюидных количественных полимеразных цепных реакций с обратной транскрипцией (RT-qPCR), обеспечивающих многомерные наборы данных для вычислительного анализа, дающего представление о функциональных сетях^20,21.

Измерение подмножества транскриптома в нейронах и глии в определенном ядре мозга генерирует набор данных, который является надежным как по количеству выборки, так и по измеренным генам, а также чувствителен и специфичен. Эти инструменты оптимальны для системного нейробиологического подхода к психическим заболеваниям, потому что глия, в основном астроциты и микроглия, продемонстрировали центральную роль в неврологических и психиатрических заболеваниях за последнее десятилетие^22,23. Наш подход может измерять экспрессивный ответ глии и нейронов одновременно через многочисленные рецепторы и лиганды, участвующие в локальной паракринной сигнализации. Действительно, сигнализация может быть выведена из этих наборов данных с использованием различных количественных методов, таких как нечеткая логика²⁴. Кроме того, идентификация клеточных субфенотипов в нейронах или глии и их функции может дать представление о том, как клетки мозга в определенных ядрах организуются, реагируют и дисрегулируются на уровне одной клетки. Динамика этой функциональной системы также может быть смоделирована с помощью экспериментов временных рядов¹⁶. Наконец, животные модели могут быть возмущены анатомически или фармакологически, чтобы придать механистическое состояние подходу этой системы.

Репрезентативный эксперимент:
Ниже мы приводим пример применения этих методов. В этом исследовании изучалась экспрессия генов нейронов и микроглии крыс в солитарном ядре (NTS) в ответ на алкогольную зависимость и последующую абстиненцию¹⁶. Когорты крыс включали 1) Контроль, 2) Этанолозависимый (EtOH), 3) 8-часовой вывод (Wd), 4) 32 ч Wd и 5) 176 ч Wd (Рисунок 1A). После быстрого обезглавливания стволы мозга отделяли от переднего мозга и криосекционировали, а срезы окрашивали для тирозингидроксилаз-положительных (TH+) нейронов и микроглии (рисунок 1B). LCM использовался для сбора как TH+, так и TH-нейронов и микроглии. Все клетки были из NTS и проанализированы как образцы 10-клеточных пулов. Четыре микрофлюидных динамических массива RT-qPCR 96 x 96 были запущены на платформе RT-qPCR, измеряя 65 генов (рисунок 1B-C). Данные нормализовали с помощью метода -ΔΔC_t и проанализировали с использованием R, а одноклеточный отбор проверяли молекулярными маркерами (рисунок 1D-E). Техническая валидация была дополнительно проверена техническими репликами, проанализированными в рамках одной партии и между партиями (рисунок 2 и рисунок 3). Нейроны TH+ и TH организованы в различные субфенотипы с аналогичными кластерами воспалительных генов, но отличающимися γ кластерами рецепторов аминомасляной кислоты (ГАМК) (R) (рисунок 4 и рисунок 5). Субфенотипы, которые имели повышенную экспрессию воспалительных кластеров генов, были чрезмерно представлены при 32 ч Wd, в то время как экспрессия ГАМК-рецептора (GABAR) оставалась низкой при длительной отмене алкоголя (176 ч Wd). Эта работа способствует антиреактивной гипотезе алкогольной и опиоидной зависимости, которая предполагает, что перехватывающая обратная связь от внутренних органов при абстиненции способствует дисрегуляции висцерально-эмоциональных нейронных ядер (т.е. НТС и миндалины), что приводит к более тяжелым вегетативным и эмоциональным последствиям, которые способствуют зависимости от вещества (рисунок 6).