Summary

Bağımlılık Davranışında Antireward Sürücülerinin Anatomik Olarak Spesifik Tek Hücreli Gen İfade Yöntemleri ile İncelenmesi

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

Lazer yakalama mikrodiseksiyonu ve mikroakışkan RT-qPCR kombinasyonu, tek nöronlarda ve gliada transkriptomun ölçülmesinde anatomik ve biyoteknik özgüllük sağlar. Psikiyatrik hastalığa bir sistemin biyoloji yaklaşımı ile yaratıcı yöntemler uygulamak, bağımlılıkta nöroinflamasyon antireward hipotezi gibi anlayış ve tedavide atılımlara yol açabilir.

Abstract

Bağımlılık davranışlarının artan oranları, ruh sağlığı araştırmacılarını ve klinisyenleri antireward ve iyileşmeyi anlamaya motive etmiştir. Ödül ve başlangıçtan bu uzaklaşma, bağımlılığı araştırmak için uygulanan yöntemlerin genişletilmesiyle birlikte yeni bakış açıları, paradigmalar ve hipotezler gerektirir. Burada bir örnek sunuyoruz: Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ve yüksek verimli mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonlarını (RT-qPCR) birleştiren antireward araştırmak için bir sistem biyolojisi yaklaşımı. Gen ekspresyon ağı dinamikleri ölçüldü ve alkol ve opioid yoksunluğunda nöroviseral disregülasyonun temel itici güçlerinden biri olan nöroinflamasyon tanımlandı. Bu teknoloji kombinasyonu, yüksek verimli duyarlılık ve spesifik gen ekspresyon ölçümleri ile tek hücreli çözünürlükte anatomik ve fenotipik özgüllük sağlar ve hem hipotez üreten veri kümeleri hem de yeni içgörüler ve tedaviler için fırsatlar yaratan mekanik olanaklar sağlar.

Introduction

Bağımlılık, gelişmiş dünyada giderek artan bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. Büyük bilimsel ve klinik ilerlemelere rağmen, bağımlılık oranları artmaya devam ederken, yerleşik tedavilerin etkinliği en iyiihtimalle sabit kalmaktadır 3,4,5. Bununla birlikte, biyoteknolojideki ilerlemeler ve bilimsel yaklaşımlar, madde bağımlılığının patofizyolojisini daha fazla araştırmak için yeni yöntem ve hipotezlere yol açmıştır 6,7,8. Nitekim, son gelişmeler, yeni kavramların ve tedavi paradigmalarının sosyal, ekonomik ve politik sonuçları olan atılımlara yol açabileceğini göstermektedir 9,10,11,12.

Alkol ve opioid bağımlılığının geri çekilmesinde antireward 13,14,15,16’yı araştırdık. Yöntemler bu paradigmanın merkezindedir17,18. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM), yüksek anatomik özgüllüğe sahip tek hücreleri seçebilir. Bu işlevsellik, nöroinflamasyon antireward hipotezinin ayrılmaz bir parçasıdır, çünkü hem glia hem de nöronlar aynı hayvandaki aynı nöronal alt çekirdekten toplanabilir ve analiz edilebilir 13,14,15,16,19. Seçilen hücrelerin transkriptomunun ilgili bir kısmı daha sonra yüksek verimli mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonları (RT-qPCR) ile ölçülebilir ve hesaplamalı analiz için yüksek boyutlu veri kümeleri sağlayarak fonksiyonel ağlara ilişkin içgörüler sağlar20,21.

Belirli bir beyin çekirdeğindeki nöronlarda ve glia’da transkriptomun bir alt kümesinin ölçülmesi, hem örnek sayısında hem de ölçülen genlerde sağlam ve hassas ve spesifik olan bir veri kümesi oluşturur. Bu araçlar, bir sistemin psikiyatrik hastalığa sinirbilim yaklaşımı için en uygunudur, çünkü glia, özellikle astrositler ve mikroglia, son on yılda nörolojik ve psikiyatrik hastalıklarda merkezi bir rol oynamıştır22,23. Yaklaşımımız, glia ve nöronların eksprese tepkisini, lokal parakrin sinyallemede yer alan çok sayıda reseptör ve ligandda eşzamanlı olarak ölçebilir. Gerçekten de, sinyalleme, bulanık mantık24 gibi çeşitli nicel yöntemler kullanılarak bu veri kümelerinden çıkarılabilir. Ayrıca, nöronlarda veya glia’da hücresel subfenotiplerin tanımlanması ve işlevleri, belirli çekirdeklerdeki beyin hücrelerinin tek hücre düzeyinde nasıl organize olduğu, tepki verdiği ve düzensizleştirildiği hakkında fikir verebilir. Bu fonksiyonel sistemin dinamikleri zaman serisi deneyleri ile de modellenebilir16. Son olarak, hayvan modelleri, bu sistemin yaklaşımına mekanik bir durum kazandırmak için anatomik veya farmakolojik olarak bozulabilir.

Temsili deney:
Aşağıda, bu yöntemlerin uygulanmasına bir örnek sunuyoruz. Bu çalışmada, alkol bağımlılığı ve ardından geri çekilmeye yanıt olarak soliter çekirdekteki (NTS) sıçan nöronal ve mikroglia gen ekspresyonu araştırılmıştır16. Sıçan kohortları 1) Kontrol, 2) Etanol bağımlı (EtOH), 3) 8 saat geri çekilme (Wd), 4) 32 saat WD ve 5) 176 saat Çar (Şekil 1A) ‘dan oluşuyordu. Hızlı dekapitasyonu takiben, beyin sapları ön beyinden ayrıldı ve kriyoseksiyona uğradı ve dilimler tirozin hidroksilaz pozitif (TH +) nöronlar ve mikroglia için boyandı (Şekil 1B). LCM, hem TH+ hem de TH- nöronlarını ve mikrogliayı toplamak için kullanıldı. Tüm hücreler NTS’dendi ve 10 hücreli havuzların örnekleri olarak analiz edildi. RT-qPCR platformunda 65 geni ölçen dört adet 96 x 96 mikroakışkan RT-qPCR dinamik dizisi çalıştırıldı (Şekil 1B-C). Veriler -ΔΔCt yöntemi kullanılarak normalleştirildi ve R kullanılarak analiz edildi ve tek hücreli seçim moleküler belirteçlerle doğrulandı (Şekil 1D-E). Teknik doğrulama, tek bir parti içinde ve partiler arasında analiz edilen teknik replikalarla daha da doğrulanmıştır (Şekil 2 ve Şekil 3). TH+ ve TH- nöronları, benzer inflamatuar gen kümeleri ile farklı alt fenotipler halinde organize olmuş, ancak farklı γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörü (R) kümeleri ( R ) ( Şekil 4 ve Şekil 5 ). İnflamatuar gen kümelerinin ekspresyonunu yükselten alt fenotipler 32 saat Çar’da aşırı temsil edilirken, GABA-reseptör (GABAR) ekspresyonu uzun süreli alkol yoksunluğunda (176 h Wd) düşük kalmıştır. Bu çalışma, yoksunlukta visseradan gelen önleyici geri bildirimin, viseral-duygusal nöronal çekirdeklerin (yani, NTS ve amigdala) düzensizliğine katkıda bulunduğunu ve madde bağımlılığına katkıda bulunan daha şiddetli otonomik ve duygusal sekellere neden olduğunu varsayan alkol ve opioid bağımlılığının antireward hipotezine katkıda bulunur (Şekil 6).

Protocol

Bu çalışma, Thomas Jefferson Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nin (IACUC) önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Protokol Thomas Jefferson Üniversitesi IACUC tarafından onaylandı. 1. Hayvan modeli Ev erkeği Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, ABD) sıçan üçüzleri ayrı ayrı etanol-chow (2 sıçan) veya kontrol-chow karışımına (1 sıçan) serbest erişim.NOT: Bu temsili deney, alkol yoksunluğunun nörobiy…

Representative Results

Tek hücreli toplamanın doğrulanması, LCM prosedürleri sırasında görsel olarak gerçekleştirilir. Hücre çekirdekleri QC istasyonunda değerlendirilir. Hücre tipi, bu hücre tipi ve genel morfolojisi için etiketli florofor emisyonu ile belirlenebilir. Kapakta istenmeyen hücreler seçilmişse, genetik materyalleri QC istasyonunda bir UV lazer ile yok edilebilir. Moleküler analiz ile daha fazla doğrulama da gereklidir. Bu temsili örnek16’da, mikrogliaya ek olarak tirozin hidroksilaz (…

Discussion

Alkol kullanım bozukluğu tedavisi zor bir hastalık olmaya devam etmektedir. Grubumuz bu bozukluğa, antireward süreçlerini sistem sinirbilimi perspektifiyle araştırarak yaklaşmıştır. Tek NTS nöronlarındaki ve mikrogliadaki gen ekspresyon değişikliklerini bir alkol yoksunluk zaman serisi16’da ölçtük. NTS, alkol yoksunluk sendromunda ortaya çıkan otonomik disregülasyondaki belirgin rolü nedeniyle seçildi. LCM’yi tek hücreli mikroakışkan RT-qPCR ile birleştirerek, anatomik …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Burada sunulan çalışma, JS ve RV’ye verilen NIH HLB U01 HL133360, JS ve EVB’ye verilen NIDA R21 DA036372, SJO’S’u desteklemek için Jan Hoek’e verilen T32 AA-007463 ve Ulusal Alkolizm ve Alkol İstismarı Enstitüsü: R01 AA018873 aracılığıyla finanse edildi.

Materials

20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

References

  1. . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  16. O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
  17. O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).

Play Video

Cite This Article
O’Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

View Video