Onderzoek naar drivers van antireward in verslavingsgedrag met anatomisch specifieke eencellige genexpressiemethoden

Verslaving blijft een groeiende uitdaging in de ontwikkelde wereld ^1,2. Ondanks grote wetenschappelijke en klinische vooruitgang, blijft het aantal verslavingen toenemen, terwijl de werkzaamheid van gevestigde behandelingen stabiel blijft op zijn best ^3,4,5. Vooruitgang in de biotechnologie en wetenschappelijke benaderingen hebben echter geleid tot nieuwe methoden en hypothesen om de pathofysiologie van stofafhankelijkheid verder te onderzoeken ^6,7,8. Recente ontwikkelingen suggereren inderdaad dat nieuwe concepten en behandelingsparadigma’s kunnen leiden tot doorbraken met sociale, economische en politieke gevolgen 9,10,11,12.

We onderzochten antireward bij het afkicken van alcohol en opioïde afhankelijkheid 13,14,15,16. Methoden staan centraal in dit paradigma^17,18. Laser capture microdissection (LCM) kan afzonderlijke cellen selecteren met een hoge anatomische specificiteit. Deze functionaliteit is een integraal onderdeel van de antirewardhypothese van neuro-inflammatie, aangezien zowel glia als neuronen kunnen worden verzameld en geanalyseerd van dezelfde neuronale subnucleus in hetzelfde dier 13,14,15,16,19. Een relevant deel van het transcriptoom van geselecteerde cellen kan vervolgens worden gemeten met high-throughput microfluïdische reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreacties (RT-qPCR) die hoogdimensionale datasets bieden voor computationele analyse die inzicht opleveren in functionele netwerken^20,21.

Het meten van een subset van het transcriptoom in neuronen en glia in een specifieke hersenkern genereert een dataset die robuust is in zowel het aantal monsters als de gemeten genen en gevoelig en specifiek is. Deze hulpmiddelen zijn optimaal voor de neurowetenschappelijke benadering van psychiatrische aandoeningen door een systeem, omdat glia, voornamelijk astrocyten en microglia, het afgelopen decennium een centrale rol hebben aangetoond bij neurologische en psychiatrische aandoeningen^22,23. Onze aanpak kan de expressieve respons van glia en neuronen gelijktijdig meten over tal van receptoren en liganden die betrokken zijn bij lokale paracriene signalering. Inderdaad, signalering kan worden afgeleid uit deze datasets met behulp van verschillende kwantitatieve methoden zoals fuzzy logic²⁴. Verder kan de identificatie van cellulaire subfenotypes in neuronen of glia en hun functie inzicht geven in hoe hersencellen in specifieke kernen zich organiseren, reageren op en ontregelen op het niveau van één cel. De dynamiek van dit functionele systeem kan ook worden gemodelleerd met tijdreeksexperimenten¹⁶. Ten slotte kunnen diermodellen anatomisch of farmacologisch worden verstoord om de benadering van dit systeem een mechanistische voorwaarde te geven.

Representatief experiment:
Hieronder geven we een voorbeeld van de toepassing van deze methoden. Deze studie onderzocht de neuronale en microglia genexpressie van ratten in de solitaire kern (NTS) als reactie op alcoholafhankelijkheid en daaropvolgende terugtrekking¹⁶. Rattencohorten bestonden uit 1) Controle, 2) Ethanol-afhankelijk (EtOH), 3) 8 uur onttrekking (Wd), 4) 32 h Wd en 5) 176 h Wd (figuur 1A). Na snelle onthoofding werden hersenstamen gescheiden van de voorhersenen en gecryopiceerd, en plakjes werden gekleurd voor tyrosinehydroxylase-positieve (TH +) neuronen en microglia (figuur 1B). LCM werd gebruikt om zowel TH+ als TH- neuronen en microglia te verzamelen. Alle cellen waren afkomstig van de NTS en geanalyseerd als monsters van 10-celpools. Vier 96 x 96 microfluïdische RT-qPCR dynamische arrays werden uitgevoerd op het RT-qPCR-platform meten 65 genen (figuur 1B-C). Gegevens werden genormaliseerd met behulp van een -ΔΔC_t-methode en geanalyseerd met behulp van R, en selectie van één cel werd gevalideerd met moleculaire markers (figuur 1D-E). Technische validatie werd verder geverifieerd door technische replica’s geanalyseerd binnen een enkele batch en over batches (figuur 2 en figuur 3). TH+ en TH- neuronen georganiseerd in verschillende subfenotypes met vergelijkbare inflammatoire genclusters, maar verschillend γ-aminoboterzuur (GABA) receptor (R) clusters (Figuur 4 en Figuur 5). Subfenotypen met verhoogde expressie van inflammatoire genclusters waren oververtegenwoordigd bij 32 h Wd, terwijl GABA-receptor (GABAR) expressie laag bleef in langdurige alcoholontwenning (176 h Wd). Dit werk draagt bij aan de antirewardhypothese van alcohol- en opioïdeafhankelijkheid die vermoedt dat interceptieve feedback van de ingewanden bij ontwenning bijdraagt aan de ontregeling van visceraal-emotionele neuronale kernen (d.w.z. NTS en amygdala), wat resulteert in ernstigere autonome en emotionele gevolgen, die bijdragen aan middelenafhankelijkheid (figuur 6).