Untersuchung von Treibern von Anti-Belohnung im Suchtverhalten mit anatomisch spezifischen Einzelzell-Genexpressionsmethoden

Sucht bleibt eine wachsende Herausforderung in den Industrieländern ^1,2. Trotz großer wissenschaftlicher und klinischer Fortschritte steigen die Suchtraten weiter an, während die Wirksamkeit etablierter Behandlungen bestenfalls stabil bleibt ^3,4,5. Fortschritte in der Biotechnologie und wissenschaftliche Ansätze haben jedoch zu neuen Methoden und Hypothesen geführt, um die Pathophysiologie der Substanzabhängigkeit weiter zu untersuchen ^6,7,8. Tatsächlich deuten jüngste Entwicklungen darauf hin, dass neuartige Konzepte und Behandlungsparadigmen zu Durchbrüchen mit sozialen, wirtschaftlichen und politischen Konsequenzen führen können 9,10,11,12.

Wir untersuchten Anti-Belohnung beim Entzug von Alkohol und Opioidabhängigkeit^13,14,15,16. Methoden sind zentral für dieses Paradigma^17,18. Die Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) kann einzelne Zellen mit hoher anatomischer Spezifität auswählen. Diese Funktionalität ist integraler Bestandteil der Neuroinflammation-Anti-Belohnungshypothese, da sowohl Gliazellen als auch Neuronen aus demselben neuronalen Subnukleus im selben Tier gesammelt und analysiert werden können 13,14,15,16,19. Ein relevanter Teil des Transkriptoms ausgewählter Zellen kann dann mit Hochdurchsatz-mikrofluidischen quantitativen Polymerase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR) gemessen werden, die hochdimensionale Datensätze für die computergestützte Analyse liefern, die Einblicke in funktionelle Netzwerke liefern^20,21.

Die Messung einer Teilmenge des Transkriptoms in Neuronen und Gliazellen in einem bestimmten Hirnkern erzeugt einen Datensatz, der sowohl in Bezug auf die Probenanzahl als auch auf die gemessenen Gene robust und sensitiv und spezifisch ist. Diese Werkzeuge sind optimal für den neurowissenschaftlichen Ansatz eines Systems für psychiatrische Erkrankungen, da Glia, hauptsächlich Astrozyten und Mikroglia, in den letzten zehn Jahren eine zentrale Rolle bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen gespielt haben^22,23. Unser Ansatz kann die expressive Reaktion von Gliazellen und Neuronen gleichzeitig über zahlreiche Rezeptoren und Liganden messen, die an der lokalen parakrinen Signalübertragung beteiligt sind. Tatsächlich kann die Signalisierung aus diesen Datensätzen mit verschiedenen quantitativen Methoden wie Fuzzy-Logik²⁴ abgeleitet werden. Darüber hinaus kann die Identifizierung zellulärer Subphänotypen in Neuronen oder Gliazellen und ihrer Funktion Aufschluss darüber geben, wie sich Gehirnzellen in bestimmten Kernen auf Einzelzellebene organisieren, darauf reagieren und sie dysregulieren. Die Dynamik dieses Funktionssystems kann auch mit Zeitreihenexperimenten^{modelliert werden 16}. Schließlich können Tiermodelle anatomisch oder pharmakologisch gestört werden, um dem Ansatz dieses Systems eine mechanistische Bedingung zu verleihen.

Repräsentatives Experiment:
Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die Anwendung dieser Methoden. Diese Studie untersuchte die neuronale und Mikroglia-Genexpression von Ratten im solitären Kern (NTS) als Reaktion auf Alkoholabhängigkeit und anschließenden Entzug¹⁶. Rattenkohorten umfassten 1) Kontrolle, 2) Ethanol-abhängig (EtOH), 3) 8-Stunden-Entzug (Wd), 4) 32 Stunden Wd und 5) 176 Stunden Wd (Abbildung 1A). Nach einer schnellen Enthauptung wurden Hirnstängel vom Vorderhirn getrennt und kryosektioniert, und Scheiben wurden für Tyrosinhydroxylase-positive (TH +) Neuronen und Mikroglia gefärbt (Abbildung 1B). LCM wurde verwendet, um sowohl TH+ als auch TH-Neuronen und Mikroglia zu sammeln. Alle Zellen stammten aus dem NTS und wurden als Proben von 10-Zell-Pools analysiert. Vier 96 x 96 mikrofluidische RT-qPCR dynamische Arrays wurden auf der RT-qPCR-Plattform mit 65 Genen durchgeführt (Abbildung 1B-C). Die Daten wurden mit einer -ΔΔC-t-Methode normalisiert und mit R analysiert, und die Einzelzellselektion wurde mit molekularen Markern validiert (Abbildung 1D-E). Die technische Validierung wurde weiter durch technische Replikate überprüft, die innerhalb einer einzelnen Charge und chargenübergreifend analysiert wurden (Abbildung 2 und Abbildung 3). TH+- und TH-Neuronen, die in verschiedenen Subphänotypen mit ähnlichen entzündlichen Genclustern, aber unterschiedlichen γ-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptor-Clustern (R) organisiert sind (Abbildung 4 und Abbildung 5). Subphänotypen, die eine erhöhte Expression von entzündlichen Genclustern aufwiesen, waren bei 32 h Wd überrepräsentiert, während die GABA-Rezeptor (GABAR) -Expression bei langwierigem Alkoholentzug niedrig blieb (176 h Wd). Diese Arbeit trägt zur Anti-Belohnungshypothese der Alkohol- und Opioidabhängigkeit bei, die vermutet, dass interzeptives Feedback von den Eingeweiden beim Entzug zur Dysregulation viszeral-emotionaler neuronaler Kerne (d.h. NTS und Amygdala) beiträgt, was zu schwereren autonomen und emotionalen Folgeerscheinungen führt, die zur Substanzabhängigkeit beitragen (Abbildung 6).