Investigación de los impulsores de la antirecompensa en el comportamiento de adicción con métodos de expresión génica unicelular anatómicamente específicos

La adicción sigue siendo un desafío creciente en el mundo desarrollado ^1,2. A pesar de los grandes avances científicos y clínicos, las tasas de adicción continúan aumentando, mientras que la eficacia de los tratamientos establecidos se mantiene estable en el mejor de los casos ^3,4,5. Sin embargo, los avances en la biotecnología y los enfoques científicos han llevado a nuevos métodos e hipótesis para investigar más a fondo la fisiopatología de la dependencia de sustancias ^6,7,8. De hecho, los desarrollos recientes sugieren que los conceptos novedosos y los paradigmas de tratamiento pueden conducir a avances con consecuencias sociales, económicas y políticas 9,10,11,12.

Se investigó la antirecompensa en la abstinencia del alcohol y la dependencia de opiáceos^13,14,15,16. Los métodos son centrales para este paradigma^17,18. La microdisección de captura láser (LCM) puede seleccionar células individuales con alta especificidad anatómica. Esta funcionalidad es parte integral de la hipótesis antirecompensa de la neuroinflamación, ya que tanto la glía como las neuronas pueden ser recolectadas y analizadas del mismo subnúcleo neuronal en el mismo animal 13,14,15,16,19. Una porción relevante del transcriptoma de las células seleccionadas se puede medir con reacciones en cadena cuantitativas de la polimerasa con transcripción inversa microfluídica de alto rendimiento (RT-qPCR) que proporcionan conjuntos de datos de alta dimensión para el análisis computacional que proporcionan información sobre redes funcionales^20,21.

La medición de un subconjunto del transcriptoma en las neuronas y la glía en un núcleo cerebral específico genera un conjunto de datos que es robusto tanto en el número de muestras como en los genes medidos y es sensible y específico. Estas herramientas son óptimas para el enfoque neurocientífico de un sistema para la enfermedad psiquiátrica porque la glía, principalmente los astrocitos y la microglía, han demostrado un papel central en la enfermedad neurológica y psiquiátrica en la última década^22,23. Nuestro enfoque puede medir la respuesta expresiva de la glía y las neuronas concomitantemente a través de numerosos receptores y ligandos involucrados en la señalización paracrina local. De hecho, la señalización se puede inferir de estos conjuntos de datos utilizando varios métodos cuantitativos, como la lógica difusa²⁴. Además, la identificación de subfenotipos celulares en neuronas o glía y su función puede proporcionar información sobre cómo las células cerebrales en núcleos específicos organizan, responden y desregulan a nivel unicelular. La dinámica de este sistema funcional también puede ser modelada con experimentos de series temporales¹⁶. Por último, los modelos animales pueden ser perturbados anatómica o farmacológicamente para dar una condición mecanicista al enfoque de este sistema.

Experimento representativo:
A continuación, proporcionamos un ejemplo de la aplicación de estos métodos. Este estudio investigó la expresión del gen neuronal y microglia de rata en el núcleo solitario (NTS) en respuesta a la dependencia del alcohol y la posterior abstinencia¹⁶. Las cohortes de ratas comprendieron 1) Control, 2) Dependiente de etanol (EtOH), 3) 8 h de retiro (Wd), 4) 32 h Wd y 5) 176 h Wd (Figura 1A). Después de una rápida decapitación, los troncos encefálicos se separaron del cerebro anterior y se crioseccionaron, y se tiñeron cortes para neuronas tirosina hidroxilasa positivas (TH +) y microglia (Figura 1B). LCM se utilizó para recolectar neuronas TH + y TH y microglia. Todas las células eran del NTS y se analizaron como muestras de grupos de 10 células. Se ejecutaron cuatro matrices dinámicas RT-qPCR microfluídicas de 96 x 96 en la plataforma RT-qPCR que mide 65 genes (Figura 1B-C). Los datos se normalizaron utilizando un método -ΔΔC_t y se analizaron utilizando R, y la selección de células individuales se validó con marcadores moleculares (Figura 1D-E). La validación técnica se verificó adicionalmente mediante réplicas técnicas analizadas dentro de un solo lote y en lotes (Figura 2 y Figura 3). Las neuronas TH + y TH organizadas en diferentes subfenotipos con grupos de genes inflamatorios similares pero diferentes grupos de receptores (R) del ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 y Figura 5). Los subfenotipos que tenían una expresión elevada de grupos de genes inflamatorios estaban sobrerrepresentados a las 32 h Wd, mientras que la expresión del receptor GABA (GABAR) se mantuvo baja en la abstinencia prolongada de alcohol (176 h Wd). Este trabajo contribuye a la hipótesis antirecompensa de la dependencia del alcohol y los opioides que conjetura que la retroalimentación interceptiva de las vísceras en la abstinencia contribuye a la desregulación de los núcleos neuronales viscerales-emocionales (es decir, NTS y amígdala) que resultan en secuelas autonómicas y emocionales más graves, que contribuyen a la dependencia de sustancias (Figura 6).