Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Valor de una línea de ratón de seguimiento de linaje
El análisis de células madre in vivo puede ser difícil ya que muchos ensayos que examinan dichas células solo se centran en caracterizar estas células en el momento de la muerte del animal, lo que representa una instantánea terminal en el tiempo. Para comprender mejor los procesos de proliferación, diferenciación y migración de progenitores, tipos de células intermedias /de transición y células maduras a lo largo del tiempo, se requiere un enfoque de análisis longitudinal. Esto se puede lograr con estudios de rastreo de linaje en los que las células madre/progenitoras se marcan indeleblemente y se pueden seguir durante cualquier período de tiempo después¹.

En el cerebro de mamíferos adultos, el proceso de neurogénesis por el cual se crean neuronas nacidas de adultos a partir de células madre y progenitoras se analizó por primera vez^a través de la retención de etiquetas con timidina-H ^{3 2,3,4} o 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU)5,6,7,8 . En estos estudios, las células proliferativas se marcaron con el análogo de timina, que se incorporó al ADN de las células durante la replicación y la división / proliferación celular. Por lo tanto, la célula marcada, así como su progenie, contenían este análogo, que luego se identificaron post mortem. Sin embargo, mientras que la timidina-H³ y BrdU permitieron el marcado de células proliferativas y su progenie en regiones del cerebro donde las células madre eran poco conocidas, estos estudios se vieron obstaculizados por las desventajas de estas herramientas. La timidina-H³ induce la detención del ciclo celular, la apoptosis y la inhibición de la síntesis de ADN dependiente de la dosis⁹, mientras que BrdU marca las células en niveles variables según la vía de administración¹⁰ y es absorbida por las células durante la reparación o la apoptosis, así como durante la división celular¹¹. Recientemente se han utilizado métodos de etiquetado más eficientes, como el etiquetado con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU), pero muchos de los mismos problemas que BrdU siguen siendo¹². Estos enfoques también son limitantes en el sentido de que marcan cualquier célula proliferativa, no solo las células madre, y por lo tanto la interpretación de los resultados puede confundirse. En el linaje neurogénico, todas las células madre y progenitoras conservan la capacidad mitótica, y solo las neuronas terminales / maduras no son proliferativas. Para los astrocitos y la microglía, pero no para los oligodendrocitos, la proliferación se mantiene indefinidamente 13,14,15.

Los ratones transgénicos utilizados para rastrear solo células que expresan una proteína de interés, como una confirmada para identificar células madre adultas como la que usamos aquí, se han vuelto más comunes cuando se investigan las células madre y su progenie. Si bien es difícil de generar a través de enfoques transgénicos de ratón, las líneas de ratón de rastreo de linaje permiten el rastreo de células específicamente marcadas en el cerebro y no dependen solo de la proliferación. En el sistema de ratón transgénico Tet-On, la administración de tetraciclina o doxiciclina (un derivado de la tetraciclina) induce la expresión de Cre-recombinasa en células que han sido diseñadas con un transactivador de tetraciclina inversa (rtTA), que es transcrito por un promotor de interés. La recombinación impulsada por Cre inducible por Tet activará la expresión de una proteína fluorescente o luminiscente indeleble en las células de interés, dependiendo del ratón Rosa-reporter empleado. Estas células marcadas indeleblemente continúan expresando este reportero después de la división, diferenciación o migración, permitiendo el seguimiento de estas células y su progenie a lo largo del tiempo o después de diferentes intervenciones¹⁶. Las ventajas de los enfoques de rastreo de linaje transgénico incluyen: 1) especificidad del rastreo a un linaje celular particular o célula progenitora / madre marcada por el rtTA, 2) expresión indeleble de la proteína fluorescente o luminiscente a pesar de la renovación o diferenciación celular, 3) baja toxicidad, 4) activación condicional durante cualquier punto del ciclo de vida del animal, y 5) facilidad de uso con ensayos comunes, incluyendo inmunotinción/inmunofluorescencia¹⁶.

Otros métodos de herramientas reporteras inducibles temporalmente en ratones incluyen el uso de ratones Cre-ERT2, que se pueden emparejar con ROSA-GFP, ROSA-mTmG u otros transgenes reporteros fluorescentes. En estos animales, un elemento regulador específico de la célula, como un promotor o potenciador de la región de interés, impulsa la producción de Cre recombinasa, que solo puede activarse mediante la administración de tamoxifeno. Si bien las líneas de ratón Cre-ERT2 permiten la inducción de Cre en líneas celulares específicas, existe una gran cantidad de conocimientos que detallan los efectos del tamoxifeno en la neurogénesis adulta^17,18. Además, existen muchos genes fluorescentes reporteros impulsados por ROSA que se pueden utilizar en lugar de GFP o mTmG, incluidos YFP o CFP, lo que permitiría un etiquetado fluorescente alternativo en otras longitudes de onda fluorescentes. Estos genes reporteros fluorescentes se pueden utilizar con sistemas Tet-On o Cre-ERT2.

La telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es el componente limitante de la velocidad de la holoenzima telomerasa, que trabaja para extender los telómeros después de que se acortan durante la división celular^19,20. TERT se ha identificado como un marcador de células madre de tejido adulto en el intestino ^21,22, médula ósea²¹, hígado²³, adiposo²⁴, endometrio^25,26 y hueso¹. Todavía se desconoce si la expresión de TERT en estas células madre adultas es únicamente para la actividad de extensión de la telomerasa o para realizar funciones TERT no canónicas²⁷. Las células madre adultas inactivas que expresan TERT (qASC) se han identificado y rastreado en todo el cuerpo con ratones de rastreo de linaje transgénico para estudiar la capacidad de multipotencia y autorrenovación de estas células madre, así como su potencial para activarse, proliferar, diferenciarse y migrar 1,22,23,28. La creación del transgén Tert-rtTA se ha realizado previamente¹. En este artículo, describiremos el uso de una línea de ratón TERT de rastreo de linaje para estudiar TERT + qASCs que hemos identificado como una nueva población de ASC en el cerebro de ratón adulto.

Generación de una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico
Para generar una línea de ratón de rastreo de linaje utilizando el sistema Tet-On, se deben combinar tres transgenes dentro de un solo animal a través del apareamiento del ratón. El primero es un rtTA, expresado bajo el control del promotor del gen de interés (el nuestro es TERT-rtTA). En una célula que expresa este gen de interés, por lo tanto, se expresará el rtTA. El segundo es un gen oTet-Cre, que contiene un elemento de respuesta de tetraciclina (TRE) que permitirá la transcripción de la cre recombinasa en presencia de una transcripción de fusión rtTA y tetraciclina o doxiciclina. La tetraciclina o la doxiciclina se pueden administrar a un animal a través de agua potable o chow²⁹. Finalmente, debe haber un gen que será activado por la escisión de la recombinasa Cre. En este manuscrito, el gen de etiquetado que describiremos es el gen Rosa26-mTmG, que hasta la recombinación de Cre transcribirá ubicuamente mTomato (fluorescencia roja de membrana en todas las células). Sin embargo, si una célula expresa la transcripción rtTA y contiene tetraciclina o doxiciclina, la recombinación cre de un conjunto de sitios lox P entre los sitios mTomato y mGFP cambiará el sitio R26 y hará que la célula produzca EGFP de membrana (mGFP, o fluorescencia verde de membrana) en lugar de tomate de membrana. La naturaleza indeleble de esta señal mGFP permitirá el etiquetado y rastreo in vivo de las células a medida que proliferan, migran y se diferencian. Siguiendo el rastro, las células se pueden analizar para la expresión de GFP a través de inmunofluorescencia en criosecciones estándar o cerebros ópticamente más gruesos.

En este artículo, describiremos el uso de la línea específica del ratón, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Para crear esta línea de ratones transgénicos triples, primero apareamos animales oTet-Cre (la cepa Jackson Lab #006234) con animales Rosa-mTmG (la cepa Jackson Lab #007676) para crear ratones transgénicos dobles oTet-Cre::Rosa-mTmG. Estos animales fueron genotipados con cebadores y plantillas de PCR indicadas en las Tablas Complementarias 1 y 2. Los ratones mTert-rtTA (creados por David Breault¹) se acoplaron a animales oTet-Cre::Rosa-mTmG para crear mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratones (Figura 1A)^1,30. El mecanismo de acción de la línea de ratón mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG se ilustra en la Figura 1B.

Diseño de inducción de doxiciclina y persecución por pulsos
Al planificar experimentos, es importante considerar varios factores que afectarán el resultado de los experimentos de rastreo de linaje, incluida la edad del animal en la inducción de doxiciclina, la duración de la administración de doxiciclina (el período de “pulso”), el período de tiempo después de la extracción de doxiciclina antes de la recolección de tejido (el período de “persecución”) y el momento de cualquier intervención durante estos procesos. Estas consideraciones de diseño del estudio son esenciales para comprender las células marcadas y su progenie al final del experimento. El primer paso en el proceso es identificar la edad de interés del animal y la duración de la administración de doxiciclina. Los períodos de pulso más largos permitirán que se exprese el potencial de que más células expresen el promotor vinculado a rtTA y que se marquen indeleblemente más células de interés. Un tipo de célula que exhibe una expresión transitoria del gen de interés puede requerir un período de pulso más largo que las células que expresan continuamente el gen de interés. Sin embargo, si el objetivo del estudio es comprender los efectos a corto plazo de la célula de interés o una intervención aguda, el período de pulso no puede ser demasiado largo, ya que una vez que se marca una célula, se rastreará a través de cualquier número de cambios durante el resto del período de pulso. En algunos de nuestros estudios, se utilizó un pulso de 2 días sin período de persecución para imitar más de cerca a un reportero directo para TERT. Esto se debe a que el tiempo mínimo para la recombinación del gen Rosa-mTmG es de 2 días³¹.

El siguiente período esencial en un experimento de persecución por pulso es la duración entre la eliminación de la doxiciclina y la perfusión del animal, también conocida como la “persecución”. La vida media de la doxiciclina en ratones es de aproximadamente 170 minutos, independientemente de la vía de administración, lo que permite concluir que es probable que la inducción de doxiciclina ya no ocurra varias horas después de la extracción³². Sin embargo, es importante tener en cuenta que el metabolismo de la doxiciclina es más lento en ratones envejecidos, lo que puede conducir a períodos de “pulso” efectivos más largos que los animales jóvenes³³.

Durante el período de persecución, las células marcadas continuarán siendo etiquetadas, incluso después de la proliferación, diferenciación o migración. La progenie de estas células también será etiquetada. El objetivo del estudio dará forma a la longitud del paradigma de la persecución de pulsos. Si el objetivo del estudio es comprender la regeneración de un tejido durante un largo período de tiempo con las células de interés, puede ser necesario un largo período de persecución. Finalmente, se debe decidir el momento de cualquier intervención o tratamiento. La administración durante el período de pulso afectará a las células que expresan el gen de interés, así como a cualquier progenie creada durante este tiempo, mientras que la administración durante el período de persecución puede afectar principalmente a la progenie de las células de interés, aunque esto dependerá de la rapidez con que las células marcadas se dividan o se diferencien. Los ejemplos de diseños experimentales de persecución de pulsos que hemos utilizado se describen en la Figura 2A.

También es importante tener en cuenta la posibilidad de una señal GFP de fondo debido a la expresión con fugas. La expresión permeable ocurre como resultado del potencial de unión inherente entre rtTA y las secuencias de Otet en ausencia de doxiciclina, y la actividad residual del transgén Otet en ausencia de rtTA (revisado en³⁴). La expresión con fugas representa una debilidad de los sistemas Tet, y aunque la fuga es a menudo una desventaja aceptable para el sistema, las situaciones en las que la expresión con fugas puede conducir a toxicidad y mortalidad, como con la toxina de la difteria (DTA) en animales Otet-DTA pueden limitar el uso de estos sistemas³⁵.

Procesamiento cerebral, seccionamiento e inmunofluorescencia de secciones delgadas para microscopía
Para analizar los cerebros de ratones después de un experimento de rastreo de linaje, los ratones primero deben ser perfundidos a través de la perfusión transcárdica para eliminar la sangre y el LCR que pueden conducir a una alta autofluorescencia en el cerebro. Hay dos fijadores de uso común con los que el animal puede ser perfundido: Histochoice Tissue Fixative, un fijador de glioxal (GF), o 4% de paraformaldehído (PFA). Los fijadores de glioxal permiten un proceso de fijación relativamente suave con menos reticulación que el PFA. Esto reduce la rigidez de los tejidos, reduce la necesidad de recuperación de antígenos y permite soluciones de anticuerpos menos concentradas durante la inmunotinción. Sin embargo, si contienen metanol esto puede servir para aumentar la autofluorescencia³⁶. Por otro lado, la PFA a menudo permitirá una fijación más robusta, y aunque se requerirá la recuperación de antígenos durante la inmunotinción, hay anticuerpos que solo funcionarán con tejidos fijos con PFA, y se requiere perfusión con PFA al 4% para la técnica de limpieza óptica descrita más adelante.

Después de la perfusión es un paso posterior a la fijación, en el que los cerebros están inmersos en el mismo tipo de fijador utilizado durante la perfusión durante la noche. Esto permite que cualquier región del cerebro que puede no haberse fijado completamente durante la perfusión continúe arreglándose. A continuación, los cerebros se incubarán en sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la mayor cantidad de agua posible antes del paso de congelación para evitar la formación de hielo dentro del tejido (“criopreservación”). Los cerebros pueden ser cortados en cualquier número de secciones de tejido sagital, coronal o transversal para su procesamiento. Tanto para la precisión como para la reproducibilidad, los bloqueos cerebrales calibrados deben usarse de una manera que garantice cortes de bregma consistentes entre animales. El factor más importante que puede afectar la forma en que se seccionan los cerebros es la región (s) del cerebro de interés. Por ejemplo, mientras que un corte sagital puede permitir que se analicen más regiones cerebrales en una sección de tejido, este corte no permitirá el análisis de regiones neuro/gliogénicas de la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) ya que los lados lateral y medial del ventrículo lateral serán imposibles de discernir en esa dimensión y se observan mejor en el plano coronal. Esta puede ser una distinción importante a hacer en los estudios de neurogénesis en adultos, ya que el lado lateral del ventrículo lateral contiene la V-SVZ neurogénica, mientras que la pared medial del ventrículo lateral es un nicho más gliogénico³⁷.

Después de que los tejidos se hayan dividido en secciones coronales, sagitales o transversales, se congelarán en bloques utilizando una solución de incrustación de temperatura de enfriamiento óptima (OCT). Aquí, los cerebros se congelan dentro de este material de incrustación, con el uso de una mezcla de hielo seco y etanol. Si se requiere un análisis de sección delgada, los bloques se cortarán en un criostato y, dependiendo del análisis posterior requerido, se pueden adherir a portaobjetos de vidrio cargados positivamente como secciones delgadas (<20 μm). También se pueden usar portaobjetos de vidrio que no están cargados, pero el uso de portaobjetos sin carga puede provocar que los tejidos se desatasquen de los portaobjetos³⁸. Si se requieren secciones de tejido de flotación libre de espesor medio (>20 μm), los tejidos se recogerán como secciones de flotación libre. Si se requieren secciones gruesas (0.5-4 mm), se requiere cortar secciones cerebrales no congeladas con un vibratomo. Es importante tener en cuenta las diferencias de almacenamiento entre las secciones de las diapositivas, que requieren congelación a -20 a -80 °C y las secciones de flotación libre, que se almacenarán a 4 °C.

Limpieza cerebral y microscopía confocal inmunofluorescente de montaje completo
Si se desea un análisis más amplio, pero menos detallado, de las células trazadas por linaje en el cerebro del ratón, es posible un análisis exhaustivo de segmentos más gruesos de tejido cerebral con la limpieza cerebral iDISCO³⁹ seguida de inmunotinción y microscopía confocal de pila Z en mosaico o microscopía de lámina de luz. Aquí, grandes secciones del cerebro del ratón se limpiarán ópticamente (un proceso de delipidación³⁹), lo que permite obtener imágenes de señal fluorescente en una sección de tejido de 1 mm. Las desventajas de este proceso son la alta autofluorescencia y una capacidad disminuida para obtener imágenes de alta resolución de la morfología celular y un análisis detallado de tinción conjunta debido al aumento de las distancias de trabajo requeridas en comparación con los métodos más tradicionales (criosecciones delgadas o secciones de flotación libre). Por esta razón, recomendamos la limpieza cerebral para analizar los resultados del rastreo de linaje a gran escala en múltiples áreas del cerebro, en lugar de intentar caracterizar o analizar células individuales.