成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

マウス線をトレースする系統の値
このような細胞を調べる多くのアッセイは、動物の死時にこれらの細胞を特徴付けることにのみ焦点を当てているため、 インビボでの 幹細胞の分析は困難な場合があります。前駆細胞、中間/移行細胞型、成熟細胞の増殖、分化、および遊走のプロセスを経時的によりよく理解するためには、縦断的な分析アプローチが必要です。これは、ステム/前駆細胞が不滅にマークされ、その後任意の時間続くことができる系統追跡研究で達成することができます¹。

成体哺乳動物の脳では、成体が生まれたニューロンが幹細胞および前駆細胞から作られる神経新生の過程を、チミジン-^{H3 2,3,4}または5-ブロモ-²‘-デオキシウリジン(BrdU)5,6,7,8による標識保持を介して最初に分析した。.これらの研究では、増殖性細胞は、複製および細胞分裂/増殖の間に細胞のDNAに組み込まれたチミン類似体でマークされた。したがって、マークされた細胞およびその子孫にはこの類似体が含まれ、死後に同定された。しかし、チミジン-^H3およびBrdUは、幹細胞がほとんど理解されていない脳領域における増殖性細胞およびその子孫のマーキングを可能にしたが、これらの研究はこれらのツールの欠点によって妨げられた。チミジン-^H3は細胞周期停止、アポトーシス、および用量依存的DNA合成阻害⁹を誘導し、BrdUは投与経路¹⁰に応じて異なるレベルで細胞をマークし、修復またはアポトーシスの間、ならびに細胞分裂¹¹の間に細胞に取り込まれる。最近、5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)による標識など、より効率的な標識法が利用されているが、BrdUと同じ問題の多くは依然として¹²のままである。これらのアプローチは、幹細胞だけでなく、増殖性細胞をマークするという点でも制限されており、したがって結果の解釈を混乱させる可能性がある。神経原性系統では、すべての幹細胞および前駆細胞が有糸分裂能力を保持し、終末期/成熟ニューロンのみが増殖性ではない。アストロサイトおよびミクログリアの場合、希突起膠細胞ではないが、増殖は無期限に維持される¹³、^14、15。

したがって、ここで使用している成体幹細胞を同定するために確認されたような、目的のタンパク質を発現する細胞のみを系統追跡するために使用されるトランスジェニックマウスは、幹細胞およびその子孫を調査する際により一般的になっている。マウストランスジェニックアプローチを通じて生成することは困難であるが、系統追跡マウスラインは、脳内の特異的にマークされた細胞の追跡を可能にし、増殖のみに依存しない。Tet-Onトランスジェニックマウス系において、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン(テトラサイクリン誘導体)の投与は、目的のプロモーターによって転写される逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)で操作された細胞におけるCre-リコンビナーゼ発現を誘導する。Tet誘導性Cre駆動組換えは、その後、使用されるRosa-レポーターマウスに応じて、目的の細胞における消えない蛍光または発光タンパク質の発現を活性化する。これらの不滅のマークされた細胞は、分裂、分化、または遊走後もこのレポーターを発現し続け、これらの細胞およびその子孫の経時的または異なる介入後に追跡することを可能にする¹⁶。トランスジェニック系統追跡アプローチの利点には、1)rtTAによって特徴付けられる特定の細胞系譜または前駆細胞/幹細胞へのトレースの特異性、2)細胞の代謝回転または分化にもかかわらず蛍光タンパク質または発光タンパク質の消去不能な発現、3)低毒性、4)動物のライフサイクルの任意の時点における条件付き活性化、および5)一般的なアッセイによる使いやすさ、 免疫染色/免疫蛍光を含む¹⁶.

マウスにおける時間的に誘導可能なレポーターツールの他の方法には、ROSA-GFP、ROSA-mTmG、または他の蛍光レポーター導入遺伝子と対合することができるCre-ERT2マウスの使用が含まれる。これらの動物では、目的のプロモーターまたはエンハンサー領域などの細胞特異的調節エレメントがCreリコンビナーゼの産生を駆動し、これはタモキシフェンの投与を介してのみ活性化され得る。Cre-ERT2マウス株は特定の細胞株におけるCreの誘導を可能にするが、成人の神経新生に対するタモキシフェンの効果を詳述する豊富な知識がある^17,18。さらに、YFPまたはCFPを含むGFPまたはmTmGの代わりに利用できる多くのROSA駆動蛍光レポーター遺伝子が存在し、他の蛍光波長における代替蛍光標識を可能にする。これらの蛍光レポーター遺伝子は、Tet-OnまたはCre-ERT2系と共に使用することができる。

テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)は、ホロ酵素テロメラーゼの律速成分であり、細胞分裂中にテロメアが短縮された後にテロメアを伸長させる働きをする^19,20。TERTは、腸21、^{22、骨髄21}、肝臓23、脂肪²⁴、子宮内膜^25、26、および骨¹における成体組織幹細胞のマーカーとして同定されている。これらの成体幹細胞におけるTERT発現が、テロメラーゼ伸長活性のみのためであるか、または非正規のTERT役割²⁷を実行するかは、依然として不明である。TERT発現静止成体幹細胞(qASC)は、これらの幹細胞の多能性と自己複製能、ならびに活性化、増殖、分化、および遊走の可能性を研究するために、トランスジェニック系統追跡マウスを用いて体全体で同定および追跡されている^1,22,23,28。Tert-rtTA導入遺伝子の作成は、以前にも^{行われてきた1}.本稿では、成体マウス脳における新規ASC集団として同定されたTERT+qASCを研究するために、TERTマウス系統をトレースする系統の使用について説明する。

トランスジェニック系統追跡マウス系統の生成
Tet-Onシステムを使用して系統追跡マウス系統を生成するには、マウスの交配を通じて3つの導入遺伝子を1つの動物内で組み合わせる必要があります。第1はrtTAであり、目的遺伝子のプロモーターの制御下で発現する(我々のものはTERT-rtTAである)。したがって、目的のこの遺伝子を発現する細胞では、rtTAが発現される。2つ目はoTet-Cre遺伝子で、rtTA融合転写産物とテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの両方の存在下でCreリコンビナーゼの転写を可能にするテトラサイクリン応答エレメント(TRE)を含む。テトラサイクリンまたはドキシサイクリンは、飲料水または固形物²⁹を介して動物に投与することができる。最後に、Creリコンビナーゼ切断によって活性化される遺伝子がなければならない。この原稿では、我々が説明する標識遺伝子はRosa26-mTmG遺伝子であり、Cre組換えまではmTomo(すべての細胞における膜赤色蛍光)を遍在的に転写する。しかし、細胞がrtTA転写産物を発現し、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを含む場合、mTomato部位とmGFP部位の間のlox P部位のセットのCre再結合はR26部位を変化させ、細胞が膜トマトの代わりに膜EGFP(mGFP、または膜緑色蛍光)を産生する原因となる。このmGFPシグナルの消えない性質は、細胞が増殖、遊遊、分化する際のin vivo標識および追跡を可能にする。痕跡に続いて、標準的な凍結切片またはより厚い光学的にクリアされた脳における免疫蛍光を介して、細胞のGFP発現について分析することができる。

本稿では、特定のマウスラインmTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGの使用について説明します。このトリプルトランスジェニックマウスラインを作成するために、我々はまずoTet-Cre動物(ジャクソンラボ株#006234)をRosa-mTmG動物(ジャクソンラボ株#007676)に交配させ、oTet-Cre::Rosa-mTmGダブルトランスジェニックマウスを作成した。これらの動物を、補足表1および2に示されるプライマーおよびPCRテンプレートを用いて遺伝子型決定した。mTert−rtTAマウス(David Breault 1によって作成された)をoTet−Cre::Rosa−mTmG動物に交配させ、mTert−rtTA::oTet−Cre::Rosa−mTmGマウスを作成した(図1A)^1、30。mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスラインの作用機序を図1Bに示す。

ドキシサイクリン誘導およびパルスチェイス設計
実験を計画する際には、ドキシサイクリン誘導時の動物の年齢、ドキシサイクリン投与の長さ(「パルス」期間)、組織採取前のドキシサイクリン除去後の時間の長さ(「追跡」期間)、およびこれらのプロセス中の介入のタイミングなど、系統追跡実験の結果に影響を与えるいくつかの要因を考慮することが重要です。これらの研究デザインの考慮事項は、実験の終了時に標識細胞とその子孫を理解するために不可欠です。このプロセスの最初のステップは、動物の関心のある年齢およびドキシサイクリン投与の長さを同定することである。より長いパルス期間は、より多くの細胞がrtTA結合プロモーターを発現し、より多くの関心のある細胞が不変にマーキングされる可能性を可能にする。目的遺伝子の一過性発現を示す細胞型は、目的遺伝子を連続的に発現する細胞よりも長いパルス期間を必要とし得る。しかし、研究の目標が目的の細胞の短期的な影響または急性介入を理解することである場合、細胞がマークされると、パルス期間の残りの部分の間に任意の数の変化をたどるため、パルス期間が長すぎることはありません。我々の研究のいくつかでは、追跡期間のない2日間のパルスを使用して、TERTの直接レポーターをより厳密に模倣した。これは、Rosa-mTmG遺伝子の組換えのための最小時間の長さが2日間³¹であるからである。

パルスチェイス実験における次の重要な期間は、ドキシサイクリンの除去と動物の灌流との間の長さであり、「チェイス」としても知られている。マウスにおけるドキシサイクリンの半減期は、投与経路にかかわらず約170分であり、ドキシサイクリン誘導は除去の数時間後にもはや起こらなくなる可能性が高いという結論を可能にする³²。しかし、ドキシサイクリン代謝は高齢マウスでは遅く、若い動物よりも長い効果的な「パルス」期間につながる可能性があることに注意することが重要です³³。

追跡期間中、標識された細胞は、増殖、分化、または遊走後でさえも標識され続けるであろう。これらの細胞の子孫も標識されるであろう。この研究の目標は、パルスチェイスパラダイムの長さを形作るでしょう。この研究の目標が、関心のある細胞との長期間にわたる組織の再生を理解することである場合、長い追跡期間が必要になることがあります。最後に、介入または治療のタイミングを決定する必要があります。パルス期間中の投与は、目的の遺伝子を発現する細胞およびこの間に作成された任意の子孫に影響を及ぼすが、追跡期間中の投与は、標識細胞が分裂または分化する速度に依存するが、目的の細胞の主に子孫に影響を及ぼす可能性がある。我々が利用したパルスチェイス実験計画の例を 図2Aに概説する。

また、発現の漏れによるバックグラウンドGFPシグナルの可能性に注意することも重要である。漏出発現は、ドキシサイクリンの非存在下でのrtTAとOtet配列との間の固有の結合能、およびrtTAの非存在下でのOtet導入遺伝子の残存活性の結果として生じる(³⁴でレビュー)。漏出性発現は、Tet系の1つの弱点を表し、漏出はしばしば系にとって許容可能な欠点であるが、漏出性発現が毒性および死亡率をもたらし得る状況、例えば、Otet−DTA動物における双翅目毒素(DTA)は、これらの系の使用を制限することができる³⁵。

顕微鏡検査のための薄切片の脳処理、切片化、免疫蛍光
系統追跡実験後にマウスの脳を分析するには、まず心経灌流 を介して マウスを灌流し、脳内で高い自己蛍光をもたらす可能性のある血液およびCSFを除去する必要があります。動物に灌流することができる2つの一般的に使用される固定剤があります:組織固定剤、グリオキサール固定剤(GF)、または4%パラホルムアルデヒド(PFA)。グリオキサール固定剤は、PFAよりも架橋の少ない比較的穏やかな固定プロセスを可能にする。これにより、組織の硬さが軽減され、抗原検索の必要性が軽減され、免疫染色中の抗体溶液の濃縮度が低くなります。しかしながら、それらがメタノールを含む場合、これは自己蛍光³⁶を増加させるのに役立ち得る。一方、PFAはより強固な固定を可能にすることが多く、免疫染色では抗原賦活化が必要になりますが、PFA固定組織でのみ機能する抗体もあり、後述する光クリアリング技術には4%PFAとの灌流が必要です。

次の灌流は固定後ステップであり、脳は一晩の灌流中に利用されるのと同じタイプの固定液に浸漬される。これにより、灌流中に完全に固定されなかった可能性のある脳領域が修正し続けることができます。次に、脳をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のスクロース中でインキュベートし、凍結工程の前にできるだけ多くの水分を除去し、組織内の氷形成を防止する(「凍結保存」)。その後、脳は、処理のために任意の数の矢状、冠状、または横方向の組織切片に切断され得る。精度と再現性の両方のために、較正された脳ブロックは、動物間で一貫したブレグマカットを保証する方法で使用する必要があります。脳のセクショニング方法に影響を与える最も重要な要因は、関心のある脳領域です。例えば、矢状切断は、1つの組織切片でより多くの脳領域を分析することを可能にするかもしれないが、この切断は、側心室の側方および内側の側面がその次元で識別することは不可能であり、冠状面においてよりよく観察されるため、心室 – 脳室下領域(V-SVZ)の神経/グリオージェニック領域の分析を可能にしない。これは、側脳室の側方に神経原性V-SVZが含まれ、側脳室の内側壁がよりグリオージェニックなニッチであるため、成人の神経新生研究において重要な区別となり得る³⁷。

組織を冠状、矢状、または横方向に分割した後、最適冷却温度(OCT)包埋溶液を使用してブロックに凍結します。ここでは、脳はこの包埋材料内で、ドライアイスとエタノールの混合物を使用して凍結されます。薄切片分析が必要な場合は、ブロックをクライオスタット上でスライスし、下流分析に応じて、正に帯電したスライドガラスを薄切片(<20μm)として接着することができます。充電されていないスライドガラスも使用することができるが、非充電スライドの使用は、組織がスライド³⁸から立ち往生しなくなる結果となり得る。中程度の厚さの自由浮遊組織切片(>20μm)が必要な場合は、組織は自由浮遊切片として収集されます。厚い切片(0.5〜4mm)が必要な場合は、ビブラトームで非凍結脳切片をスライスする必要があります。-20 ~ -80 °C での凍結を必要とするスライド上のセクションと、4 °C で保存されるフリーフローティングセクションの保管の違いに注意することが重要です。

脳クリアリングとホールマウント免疫蛍光共焦点顕微鏡
マウス脳内の系統トレース細胞のより広範で、まだ詳細ではない分析が必要な場合は、iDISCO脳クリア^リング39 に続いて免疫染色およびタイル状zスタック共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡法を用いて、脳組織のより厚いセグメントの包括的な分析が可能である。ここでは、マウス脳の大部分が光学的にクリアされ(脱脂プロセス³⁹)、1mmの組織切片全体にわたって蛍光シグナルイメージングがより良好に可能になる。このプロセスの欠点は、より伝統的な方法(薄い凍結切片または自由に浮遊する切片)と比較して必要な作動距離の増加により、高い自己蛍光と細胞形態の高解像度画像および詳細な共染色分析を得る能力の低下である。このため、個々の細胞の特性評価や解析を試みるのではなく、複数の脳領域にわたる大規模な系統追跡結果を解析するために、脳クリアリングを推奨します。