Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Valeur d’une ligne de souris de traçage de lignée
L’analyse des cellules souches in vivo peut être difficile car de nombreux essais qui examinent ces cellules ne se concentrent que sur la caractérisation de ces cellules au moment de la mort de l’animal, ce qui représente un instantané terminal dans le temps. Pour mieux comprendre les processus de prolifération, de différenciation et de migration des progéniteurs, des types de cellules intermédiaires/de transition et des cellules matures au fil du temps, une approche d’analyse longitudinale est nécessaire. Ceci peut être réalisé avec des études de traçage de lignée dans lesquelles les cellules souches / progénitrices sont marquées de manière indélébile et peuvent être suivies pendant toute la durée après¹.

Dans le cerveau des mammifères adultes, le processus de neurogenèse par lequel les neurones nés à l’âge adulte sont créés à partir de cellules souches et progénitrices a d’abord été analysé par rétention d’étiquette avec la thymidine-H^{3 2,3,4} ou la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU)^5,6,7,8 . Dans ces études, les cellules prolifératives ont été marquées avec l’analogue de la thymine, qui a été incorporé dans l’ADN des cellules pendant la réplication et la division / prolifération cellulaire. La cellule marquée, ainsi que leur progéniture, contenaient donc cet analogue, qui ont ensuite été identifiés post-mortem. Cependant, alors que la thymidine-H3 et BrdU ont permis le marquage des cellules prolifératives et de leur descendance dans les régions du cerveau où les cellules souches étaient mal comprises, ces études ont été entravées par les inconvénients de ces outils. La thymidine-H³ induit l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose et l’inhibition de la synthèse de l’ADN dose-dépendante⁹, tandis que BrdU marque les cellules à des niveaux variables selon la voie d’administration¹⁰ et est absorbé par les cellules pendant la réparation ou l’apoptose, ainsi que pendant la division cellulaire¹¹. Des méthodes de marquage plus efficaces ont été utilisées récemment, telles que le marquage avec la 5-éthynyyl-2′-désoxyuridine (EdU), mais bon nombre des mêmes problèmes que BrdU restent¹². Ces approches sont également limitatives en ce sens qu’elles marquent toute cellule proliférative, pas seulement les cellules souches, et donc l’interprétation des résultats peut être confondue. Dans la lignée neurogène, toutes les cellules souches et progénitrices conservent la capacité mitotique, et seuls les neurones terminaux / matures ne sont pas prolifératifs. Pour les astrocytes et les microglies, mais pas pour les oligodendrocytes, la prolifération est maintenue indéfiniment 13,14,15.

Les souris transgéniques utilisées pour tracer uniquement les cellules qui expriment une protéine d’intérêt, telle que celle confirmée pour identifier les cellules souches adultes que nous utilisons ici, sont donc devenues plus courantes lors de l’étude des cellules souches et de leur progéniture. Bien qu’il soit difficile de générer des approches transgéniques de souris, les lignées de souris traçant la lignée permettent de tracer des cellules spécifiquement marquées dans le cerveau et ne dépendent pas uniquement de la prolifération. Dans le système de souris transgénique Tet-On, l’administration de tétracycline ou de doxycycline (un dérivé de la tétracycline) induit l’expression de la Cre-recombinase dans les cellules qui ont été conçues avec un transactivateur de tétracycline inverse (rtTA), qui est transcrit par un promoteur d’intérêt. La recombinaison induite par Le Tet et le Cre activera alors l’expression d’une protéine fluorescente ou luminescente indélébile dans les cellules d’intérêt, selon la souris Rosa-reporter employée. Ces cellules marquées de manière indélébile continuent d’exprimer ce rapporteur après division, différenciation ou migration, permettant le suivi de ces cellules et de leur progéniture au fil du temps ou après différentes interventions¹⁶. Les avantages des approches transgéniques de traçage de la lignée comprennent : 1) la spécificité du traçage à une lignée cellulaire particulière ou à un progéniteur/cellule souche marquée par le rtTA, 2) l’expression indélébile de la protéine fluorescente ou luminescente malgré le renouvellement ou la différenciation cellulaire, 3) une faible toxicité, 4) une activation conditionnelle à tout moment du cycle de vie de l’animal et 5) une facilité d’utilisation avec des essais courants, y compris l’immunocoloration/immunofluorescence¹⁶.

D’autres méthodes d’outils rapporteurs inductibles temporellement chez la souris comprennent l’utilisation de souris Cre-ERT2, qui peuvent être associées à ROSA-GFP, ROSA-mTmG ou à d’autres transgènes rapporteurs fluorescents. Chez ces animaux, un élément régulateur spécifique à la cellule, tel qu’un promoteur ou une région d’intérêt amplificateur, entraîne la production de Cre recombinase, qui ne peut être activée que par l’administration de tamoxifène. Alors que les lignées de souris Cre-ERT2 permettent l’induction de Cre dans des lignées cellulaires spécifiques, il existe une mine de connaissances détaillant les effets du tamoxifène sur la neurogenèse adulte^17,18. De plus, il existe de nombreux gènes rapporteurs fluorescents pilotés par ROSA qui peuvent être utilisés à la place de GFP ou mTmG, y compris YFP ou CFP, ce qui permettrait un marquage fluorescent alternatif dans d’autres longueurs d’onde fluorescentes. Ces gènes rapporteurs fluorescents peuvent être utilisés avec les systèmes Tet-On ou Cre-ERT2.

La transcriptase inverse de la télomérase (TERT) est le composant limitant le taux de l’holoenzyme télomérase, qui agit pour étendre les télomères après leur raccourcissement pendant la division cellulaire^19,20. TerT a été identifié comme un marqueur des cellules souches tissulaires adultes dans l’intestin^21,22, la moelle osseuse²¹, le foie²³, adipeux²⁴, l’endomètre^25,26 et l’os¹. On ne sait toujours pas si l’expression de TERT dans ces cellules souches adultes est uniquement destinée à l’activité d’extension de la télomérase ou à l’exécution de rôles TERT non canoniques²⁷. Des cellules souches adultes quiescentes exprimant le TERT (qASC) ont été identifiées et tracées dans tout le corps avec des souris traçant la lignée transgénique pour étudier la multipotence et la capacité d’auto-renouvellement de ces cellules souches, ainsi que leur potentiel d’activation, de prolifération, de différenciation et de migration 1,22,23,28. La création du transgène Tert-rtTA a été réalisée précédemment¹. Dans cet article, nous décrirons l’utilisation d’une lignée traçant la lignée TERT pour étudier les TERT + qASC que nous avons identifiés comme une nouvelle population ASC dans le cerveau de souris adultes.

Génération d’une lignée transgénique traçant la lignée de souris
Pour générer une lignée de souris traçant la lignée à l’aide du système Tet-On, trois transgènes doivent être combinés au sein d’un seul animal par accouplement de souris. Le premier est un rtTA, exprimé sous le contrôle du promoteur du gène d’intérêt (le nôtre est TERT-rtTA). Dans une cellule qui exprime ce gène d’intérêt, le rtTA sera donc exprimé. Le second est un gène oTet-Cre, qui contient un élément de réponse à la tétracycline (TRE) qui permettra la transcription de la Cre recombinase en présence à la fois d’un transcrit de fusion rtTA et de tétracycline ou d’une doxycycline. La tétracycline ou la doxycycline peut être administrée à un animal via de l’eau potable ou du chow²⁹. Enfin, il doit y avoir un gène qui sera activé par le clivage de la Cre recombinase. Dans ce manuscrit, le gène de marquage que nous décrirons est le gène Rosa26-mTmG, qui, jusqu’à la recombinaison Cre, transcrira de manière omniprésente mTomato (fluorescence rouge membranaire dans toutes les cellules). Cependant, si une cellule exprime le transcrit rtTA et contient de la tétracycline ou de la doxycycline, la recombinaison Cre d’un ensemble de sites lox P entre les sites mTomato et mGFP modifiera le site R26 et amènera la cellule à produire de l’EGFP membranaire (mGFP, ou fluorescence verte membranaire) au lieu de la tomate membranaire. La nature indélébile de ce signal mGFP permettra le marquage et le traçage in vivo des cellules à mesure qu’elles prolifèrent, migrent et se différencient. Après la trace, les cellules peuvent être analysées pour l’expression de GFP via l’immunofluorescence dans des cryosections standard ou des cerveaux optiquement plus épais.

Dans cet article, nous décrirons l’utilisation de la ligne de souris spécifique, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Pour créer cette triple lignée de souris transgéniques, nous avons d’abord accouplé des animaux oTet-Cre (souche Jackson Lab #006234) à des animaux Rosa-mTmG (souche Jackson Lab #007676) pour créer des souris transgéniques doubles oTet-Cre::Rosa-mTmG. Ces animaux ont été génotypés à l’aide d’amorces et de modèles de PCR indiqués dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Des souris mTert-rtTA (créées par David Breault¹) ont été accouplées à des animaux oTet-Cre::Rosa-mTmG pour créer des souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (Figure 1A)^1,30. Le mécanisme d’action de la ligne de souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG est illustré à la figure 1B.

Induction de la doxycycline et conception de la chasse aux impulsions
Lors de la planification d’expériences, il est important de prendre en compte plusieurs facteurs qui affecteront le résultat des expériences de traçage de lignée, y compris l’âge de l’animal à l’induction de la doxycycline, la durée de l’administration de la doxycycline (la période « pouls »), la durée après l’élimination de la doxycycline avant le prélèvement de tissus (la période de « poursuite ») et le moment de toute intervention au cours de ces processus. Ces considérations de conception d’étude sont essentielles pour comprendre les cellules étiquetées et leur progéniture à la fin de l’expérience. La première étape du processus consiste à identifier l’âge d’intérêt de l’animal et la durée de l’administration de doxycycline. Des périodes d’impulsion plus longues permettront d’exprimer le promoteur lié à la rtTA et de marquer de manière indélébile davantage de cellules d’intérêt. Un type de cellule qui présente une expression transitoire du gène d’intérêt peut nécessiter une période d’impulsion plus longue que les cellules qui expriment continuellement le gène d’intérêt. Cependant, si l’objectif de l’étude est de comprendre les effets à court terme de la cellule d’intérêt ou d’une intervention aiguë, la période de pouls ne peut pas être trop longue, car une fois qu’une cellule est marquée, elle sera tracée à travers un certain nombre de changements pendant le reste de la période de pouls. Dans certaines de nos études, un pouls de 2 jours sans période de poursuite a été utilisé pour imiter plus étroitement un rapporteur direct pour TERT. En effet, la durée minimale de recombinaison du gène Rosa-mTmG est de 2 jours³¹.

La prochaine période essentielle dans une expérience de chasse au pouls est la longueur entre l’élimination de la doxycycline et la perfusion de l’animal, également connue sous le nom de « poursuite ». La demi-vie de la doxycycline chez la souris est d’environ 170 minutes, quelle que soit la voie d’administration, ce qui permet de conclure que l’induction de la doxycycline ne se produit probablement plus plusieurs heures après l’ablation³². Cependant, il est important de noter que le métabolisme de la doxycycline est plus lent chez les souris âgées, ce qui peut entraîner des périodes de « pouls » efficaces plus longues que les jeunes animaux³³.

Pendant la période de chasse, les cellules marquées continueront d’être marquées, même après prolifération, différenciation ou migration. La descendance de ces cellules sera également marquée. L’objectif de l’étude façonnera la longueur du paradigme de la chasse au pouls. Si l’objectif de l’étude est de comprendre la régénération d’un tissu sur une longue période de temps avec les cellules d’intérêt, une longue période de poursuite peut être nécessaire. Enfin, le calendrier des interventions ou des traitements doit être décidé. L’administration pendant la période de pouls affectera les cellules exprimant le gène d’intérêt ainsi que toute progéniture créée pendant cette période, tandis que l’administration pendant la période de chasse peut affecter principalement la progéniture des cellules d’intérêt, bien que cela dépende de la rapidité avec laquelle les cellules marquées se divisent ou se différencient. Des exemples de plans expérimentaux de chasse aux impulsions que nous avons utilisés sont décrits à la figure 2A.

Il est également important d’être conscient de la possibilité d’un signal GFP de fond en raison d’une expression qui fuit. L’expression perméable se produit en raison du potentiel de liaison inhérent entre le rtTA et les séquences d’Otet en l’absence de doxycycline, et de l’activité résiduelle du transgène d’Otet en l’absence de rtTA (revue en³⁴). L’expression perméable représente une faiblesse des systèmes Tet, et bien que la fuite soit souvent un inconvénient acceptable du système, les situations où l’expression perméable peut entraîner une toxicité et une mortalité, comme avec la toxine diphtérique (DTA) chez les animaux Otet-DTA peuvent limiter l’utilisation de ces systèmes³⁵.

Traitement du cerveau, sectionnement et immunofluorescence de sections minces pour la microscopie
Pour analyser le cerveau de souris après une expérience de traçage de lignée, les souris doivent d’abord être perfusées par perfusion transcardique pour éliminer le sang et le LCR qui peuvent conduire à une autofluorescence élevée dans le cerveau. Il existe deux fixateurs couramment utilisés avec lesquels l’animal peut être perfusé: le fixateur tissulaire histochoice, un fixateur glyoxal (GF) ou le paraformaldéhyde à 4% (PFA). Les fixateurs de glyoxal permettent un processus de fixation relativement doux avec moins de réticulation que le PFA. Cela réduit la rigidité des tissus, réduit le besoin de récupération de l’antigène et permet des solutions d’anticorps moins concentrées pendant l’immunocoloration. Cependant, s’ils contiennent du méthanol, cela peut servir à augmenter l’autofluorescence³⁶. D’autre part, le PFA permettra souvent une fixation plus robuste, et bien que la récupération de l’antigène soit nécessaire pendant l’immunocoloration, il existe des anticorps qui ne fonctionneront qu’avec des tissus fixés au PFA, et une perfusion avec 4% de PFA est nécessaire pour la technique de nettoyage optique décrite plus loin.

Après la perfusion est une étape post-fixation, dans laquelle les cerveaux sont immergés dans le même type de fixateur utilisé pendant la perfusion pendant la nuit. Cela permet à toutes les régions du cerveau qui n’ont peut-être pas été complètement fixées pendant la perfusion de continuer à se réparer. Ensuite, les cerveaux seront incubés dans du saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer autant d’eau que possible avant l’étape de congélation afin d’empêcher la formation de glace dans le tissu (« cryo-préservation »). Les cerveaux peuvent ensuite être coupés en un certain nombre de coupes de tissus sagittaux, coronaires ou transversaux pour traitement. Pour la précision et la reproductibilité, les blocs cérébraux calibrés doivent être utilisés de manière à assurer des coupes de bregma cohérentes entre les animaux. Le facteur le plus important qui peut affecter la façon dont les cerveaux sont sectionnés est la ou les régions du cerveau d’intérêt. Par exemple, alors qu’une coupure sagittale peut permettre d’analyser plus de régions du cerveau dans une section de tissu, cette coupure ne permettra pas d’analyser les régions neuro/gliogéniques de la zone ventriculaire-sous-ventriculaire (V-SVZ) car les côtés latéraux et médians du ventricule latéral seront impossibles à discerner dans cette dimension et sont mieux observés dans le plan coronal. Cela peut être une distinction importante à faire dans les études de neurogenèse adulte, car le côté latéral du ventricule latéral contient le V-SVZ neurogène, tandis que la paroi médiale du ventricule latéral est une niche plus gliogénique³⁷.

Une fois que les tissus ont été divisés en sections coronales, sagittales ou transversales, ils seront congelés en blocs à l’aide de la solution d’incorporation à température de refroidissement optimale (OCT). Ici, les cerveaux sont congelés dans ce matériau d’intégration, avec l’utilisation d’un mélange de glace carbonique et d’éthanol. Si une analyse de section mince est nécessaire, les blocs seront tranchés sur un cryostat et, en fonction de l’analyse en aval requise, peuvent être collés à des lames de verre chargées positivement sous forme de sections minces (<20 μm). Les lames de verre qui ne sont pas chargées peuvent également être utilisées, mais l’utilisation de lames non chargées peut entraîner le déblocage des tissus des lames³⁸. Si des coupes de tissu flottant libre d’épaisseur moyenne (>20 μm) sont nécessaires, les tissus seront prélevés sous forme de sections flottantes. Si des sections épaisses (0,5-4 mm) sont nécessaires, il est nécessaire de trancher des sections cérébrales non congelées avec un vibratome. Il est important de noter les différences de stockage entre les sections sur les lames, qui nécessitent une congélation à -20 à -80 ° C et les sections flottantes, qui seront stockées à 4 ° C.

Nettoyage du cerveau et microscopie confocale immunofluorescente à montage entier
Si une analyse plus large, mais moins détaillée, des cellules tracées par la lignée dans le cerveau de la souris est souhaitée, une analyse complète des segments plus épais du tissu cérébral est possible avec iDISCO brain clearing³⁹ suivi d’une immunocoloration et d’une microscopie confocale z-stack carrelée ou d’une microscopie à feuille de lumière. Ici, de grandes sections du cerveau de la souris seront optiquement nettoyées (un processus de délipidation³⁹), ce qui permet mieux l’imagerie du signal fluorescent sur une section de tissu de 1 mm. Les inconvénients de ce processus sont une autofluorescence élevée et une capacité réduite à obtenir des images haute résolution de la morphologie cellulaire et une analyse détaillée de la cocoloration en raison des distances de travail accrues requises par rapport aux méthodes plus traditionnelles (cryosections minces ou sections flottantes). Pour cette raison, nous recommandons l’éclaircissement du cerveau pour analyser les résultats du traçage de la lignée à grande échelle dans plusieurs zones du cerveau, au lieu d’essayer de caractériser ou d’analyser des cellules individuelles.