Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Soy izleme fare çizgisinin değeri
Kök hücrelerin in vivo analizi zor olabilir, çünkü bu tür hücreleri inceleyen birçok tahlil, yalnızca hayvanın ölümü sırasında bu hücreleri karakterize etmeye odaklanır ve bu da zaman içinde bir terminal anlık görüntüsünü temsil eder. Progenitör, ara / geçiş hücre tipleri ve olgun hücrelerin zaman içinde proliferasyon, farklılaşma ve göç süreçlerini daha iyi anlamak için uzunlamasına bir analiz yaklaşımı gereklidir. Bu, kök / progenitör hücrelerin silinmez bir şekilde işaretlendiği ve daha sonra herhangi bir süre boyunca takip edilebileceği soy izleme çalışmaları ile sağlanabilir¹.

Yetişkin memeli beyninde, yetişkin doğumlu nöronların kök ve progenitör hücrelerden yaratıldığı nörogenez süreci ilk olarak timidin-H 3^2,3,4 veya 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) ile etiket retansiyonu yoluyla analiz edilmiştir5,6,7,8 . Bu çalışmalarda, proliferatif hücreler, replikasyon ve hücre bölünmesi / proliferasyonu sırasında hücrelerin DNA’sına dahil edilen timin analoğu ile işaretlenmiştir. İşaretli hücre ve onların soyları, bu nedenle, daha sonra ölüm sonrası tanımlanan bu analogu içeriyordu. Bununla birlikte, timidin-H3 ve BrdU, kök hücrelerin yeterince anlaşılmadığı beyin bölgelerinde proliferatif hücrelerin ve soylarının işaretlenmesine izin verirken, bu çalışmalar bu araçların dezavantajları tarafından engellenmiştir. Timidin-H3, hücre döngüsü arresti, apoptozu ve doza bağımlı DNA sentezi inhibisyonunu inhibe 9’a indüklerken, BrdU, uygulama yoluna bağlı olarak hücreleri¹⁰ olarak değiştirir ve onarım veya apoptoz sırasında ve ayrıca hücre bölünmesi sırasında hücreler tarafından alınır¹¹. Son zamanlarda 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ile etiketleme gibi daha verimli etiketleme yöntemleri kullanılmıştır, ancak BrdU ile aynı sorunların çoğu hala¹² olarak kalmaktadır. Bu yaklaşımlar, sadece kök hücreleri değil, herhangi bir proliferatif hücreyi işaretlemeleri açısından da sınırlayıcıdır ve bu nedenle sonuçların yorumlanması karıştırılabilir. Nörojenik soyda, tüm kök ve progenitör hücreler mitotik kapasiteyi korur ve sadece terminal / olgun nöronlar proliferatif değildir. Astrositler ve mikroglia için, ancak oligodendrositler için değil, proliferasyon süresiz olarak korunur^13,14,15.

Burada kullandığımız yetişkin kök hücreleri tanımlamak için onaylanan gibi, yalnızca ilgilenilen bir proteini ifade eden hücreleri izlemek için kullanılan transgenik fareler, bu nedenle kök hücreleri ve soylarını araştırırken daha yaygın hale gelmiştir. Fare transgenik yaklaşımlarıyla üretilmesi zor olsa da, soy izleme fare çizgileri beyinde özel olarak işaretlenmiş hücrelerin izlenmesine izin verir ve yalnızca çoğalmaya dayanmaz. Tet-On transgenik fare sisteminde, tetrasiklin veya doksisiklin (bir tetrasiklin türevi) uygulanması, bir ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) ile tasarlanmış hücrelerde Cre-rekombinaz ekspresyonunu indükler. Tet ile indüklenebilir Cre-driven rekombinasyon, kullanılan Rosa-reporter faresine bağlı olarak, ilgili hücrelerde silinmez bir floresan veya ışıldayan proteinin ekspresyonunu aktive edecektir. Bu silinmez şekilde işaretlenmiş hücreler, bölünme, farklılaşma veya göçten sonra bu muhabiri ifade etmeye devam ederek, bu hücrelerin ve soylarının zaman içinde veya farklı müdahalelerden sonra izlenmesine izin verir¹⁶. Transgenik soy izleme yaklaşımlarının avantajları şunlardır: 1) rtTA ile işaretlenmiş belirli bir hücre soyuna veya progenitör / kök hücreye izlemenin özgüllüğü, 2) hücre döngüsüne veya farklılaşmasına rağmen floresan veya ışıldayan proteinin silinmez ifadesi, 3) düşük toksisite, 4) hayvanın yaşam döngüsünün herhangi bir noktasında koşullu aktivasyon ve 5) ortak tahlillerle kullanım kolaylığı, immünoboyama/immünofloresan dahil¹⁶.

Farelerde geçici olarak indüklenebilir muhabir araçlarının diğer yöntemleri, ROSA-GFP, ROSA-mTmG veya diğer floresan muhabir transgenleri ile eşleştirilebilen Cre-ERT2 farelerinin kullanımını içerir. Bu hayvanlarda, bir promotör veya arttırıcı bölge gibi hücreye özgü bir düzenleyici unsur, yalnızca tamoksifen uygulaması yoluyla aktive edilebilen Cre rekombinaz üretimini yönlendirir. Cre-ERT2 fare çizgileri, belirli hücre hatlarında Cre’nin indüksiyonuna izin verirken, tamoksifenin yetişkin nörogenezi^17,18 üzerindeki etkilerini detaylandıran zengin bir bilgi birikimi vardır. Ek olarak, YFP veya CFP de dahil olmak üzere GFP veya mTmG yerine kullanılabilecek birçok ROSA-güdümlü floresan muhabir geni vardır, bu da diğer floresan dalga boylarında alternatif floresan etiketlemeye izin verecektir. Bu floresan muhabir genleri Tet-On veya Cre-ERT2 sistemleri ile kullanılabilir.

Telomeraz ters transkriptaz (TERT), holoenzim telomerazın hız sınırlayıcı bileşenidir ve hücre bölünmesi^19,20 sırasında kısaltıldıktan sonra telomerleri genişletmek için çalışır. TERT, bağırsak 21,22, kemik iliği 21, karaciğer 23, yağ ²⁴, endometriyum^25,26 ve kemik ^1’deki yetişkin doku kök hücrelerinin bir belirteci olarak tanımlanmıştır. Bu yetişkin kök hücrelerdeki TERT ekspresyonunun sadece telomeraz uzatıcı aktivite için mi yoksa kanonik olmayan TERT rollerini yerine getirmek için mi olduğu hala bilinmemektedir²⁷. TERT eksprese eden sessiz yetişkin kök hücreler (qASC’ler), bu kök hücrelerin çok etkili ve kendini yenileme yeteneğinin yanı sıra aktive etme, çoğalma, farklılaşma ve göç etme potansiyellerini incelemek için transgenik soy izleme fareleri ile vücutta tanımlanmış ve izlenmiştir 1,22,23,28. Tert-rtTA transgeninin oluşturulması daha önce^{gerçekleştirilmiştir 1}. Bu yazıda, yetişkin fare beyninde yeni bir ASC popülasyonu olarak tanımladığımız TERT + qASC’leri incelemek için bir soy izleme TERT fare çizgisinin kullanımını açıklayacağız.

Transgenik bir soy izleme fare çizgisinin oluşturulması
Tet-On sistemini kullanarak soy izleme fare çizgisi oluşturmak için, fare çiftleşmesi yoluyla tek bir hayvanda üç transgen birleştirilmelidir. Birincisi, ilgilenilen genin promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir rtTA’dır (bizimki TERT-rtTA’dır). Bu ilgi genini ifade eden bir hücrede, rtTA bu nedenle ifade edilecektir. İkincisi, hem rtTA füzyon transkriptinin hem de tetrasiklin veya doksisiklin varlığında Cre rekombinazının transkripsiyonuna izin verecek bir tetrasiklin yanıt elemanı (TRE) içeren bir oTet-Cre genidir. Tetrasiklin veya doksisiklin bir hayvana içme suyu veya chow²⁹ yoluyla uygulanabilir. Son olarak, Cre rekombinaz bölünmesi ile aktive edilecek bir gen olmalıdır. Bu yazıda, tanımlayacağımız etiketleme geni, Cre rekombinasyonuna kadar her yerde mTomato’yu (tüm hücrelerde membran kırmızısı floresan) transkripte edecek olan Rosa26-mTmG genidir. Bununla birlikte, eğer bir hücre rtTA transkriptini ifade ederse ve tetrasiklin veya doksisiklin içeriyorsa, mDomates ve mGFP bölgeleri arasındaki bir dizi lox P bölgesinin Cre rekombinasyonu, R26 bölgesini değiştirecek ve hücrenin membran domates yerine membran EGFP (mGFP veya membran yeşil floresan) üretmesine neden olacaktır. Bu mGFP sinyalinin silinmez doğası, çoğalırken, göç ederken ve farklılaşırken hücrelerin in vivo etiketlenmesine ve izlenmesine izin verecektir. İzi takiben, hücreler standart kriyoseksiyonlarda veya daha kalın optik olarak temizlenmiş beyinlerde immünofloresan yoluyla GFP’nin ekspresyonu için analiz edilebilir.

Bu yazıda, belirli fare çizgisi olan mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG’nin kullanımını açıklayacağız. Bu üçlü transgenik fare hattını oluşturmak için, oTet-Cre hayvanlarını (Jackson Lab suşu #006234) Rosa-mTmG hayvanlarıyla (Jackson Lab suşu #007676) çiftleştirdik ve oTet-Cre::Rosa-mTmG çift transgenik fareler oluşturduk. Bu hayvanlar, Ek Tablo 1 ve 2’de belirtilen primerler ve PCR şablonları ile genotiplendirildi. mTert-rtTA fareleri (David Breault 1 tarafından yaratılmıştır) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fareleri oluşturmak için oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla çiftleştirilmiştir (Şekil 1A)^1,30. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare çizgisinin etki mekanizması Şekil 1B’de gösterilmiştir.

Doksisiklin indüksiyonu ve nabız kovalama tasarımı
Deneyleri planlarken, hayvanın doksisiklin indüksiyonundaki yaşı, doksisiklin uygulamasının uzunluğu (“nabız” dönemi), doku toplanmasından önce doksisiklin çıkarılmasından sonraki sürenin uzunluğu (“kovalamaca” dönemi) ve bu işlemler sırasında herhangi bir müdahalenin zamanlaması dahil olmak üzere soy izleme deneylerinin sonucunu etkileyecek çeşitli faktörleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu çalışma tasarımı hususları, etiketli hücreleri ve bunların soylarını deneyin sonunda anlamak için gereklidir. Süreçteki ilk adım, hayvanın ilgi yaşını ve doksisiklin uygulamasının uzunluğunu tanımlamaktır. Daha uzun nabız süreleri, daha fazla hücrenin rtTA’ya bağlı promotörün eksprese edilmesini ve daha fazla ilgi çekici hücrenin silinmez bir şekilde işaretlenmesini sağlayacaktır. İlgilenilen genin geçici ekspresyonunu sergileyen bir hücre tipi, ilgilenilen geni sürekli olarak ifade eden hücrelerden daha uzun bir nabız süresi gerektirebilir. Bununla birlikte, çalışmanın amacı, ilgilenilen hücrenin veya akut bir müdahalenin kısa vadeli etkilerini anlamaksa, nabız periyodu çok uzun olamaz, çünkü bir hücre işaretlendiğinde, nabız periyodunun geri kalanında herhangi bir sayıda değişiklikle izlenecektir. Bazı çalışmalarımızda, TERT için doğrudan muhabiri daha yakından taklit etmek için kovalamaca süresi olmayan 2 günlük bir nabız kullanılmıştır. Bunun nedeni, Rosa-mTmG geninin rekombinasyonu için minimum sürenin 2 gün³¹ olmasıdır.

Bir nabız kovalama deneyindeki bir sonraki temel dönem, doksisiklin ile hayvanın perfüzyonu arasındaki uzunluktur, aynı zamanda ‘kovalamaca’ olarak da bilinir. Farelerde doksisiklin yarı ömrü, uygulama yolundan bağımsız olarak yaklaşık 170 dakikadır ve doksisiklin indüksiyonunun çıkarıldıktan birkaç saat sonra³² artık gerçekleşmediği sonucuna varılmasına izin verir. Bununla birlikte, doksisiklin metabolizmasının yaşlı farelerde daha yavaş olduğunu ve bunun da genç hayvanlardan daha uzun etkili ‘nabız’ dönemlerine yol açabileceğini belirtmek önemlidir³³.

Kovalama döneminde, etiketlenmiş hücreler çoğalma, farklılaşma veya göçten sonra bile etiketlenmeye devam edecektir. Bu hücrelerin soyu da etiketlenecektir. Çalışmanın amacı, nabız kovalama paradigmasının uzunluğunu şekillendirecektir. Çalışmanın amacı, bir dokunun ilgilenilen hücrelerle uzun bir süre boyunca yenilenmesini anlamaksa, uzun bir kovalamaca süresi gerekebilir. Son olarak, herhangi bir müdahalenin veya tedavinin zamanlamasına karar verilmelidir. Nabız periyodu sırasında uygulama, bu süre zarfında yaratılan herhangi bir soyu olduğu kadar ilgi genini ifade eden hücreleri de etkileyecektir, oysa kovalamaca döneminde uygulama, çoğunlukla ilgili hücrelerin soyunu etkileyebilir, ancak bu, etiketlenmiş hücrelerin ne kadar hızlı bölündüğüne veya farklılaştığına bağlı olacaktır. Kullandığımız nabız kovalama deneysel tasarımlarının örnekleri Şekil 2A’da özetlenmiştir.

Sızdıran ifade nedeniyle arka plan GFP sinyalinin olasılığının farkında olmak da önemlidir. Sızdıran ekspresyon, doksisiklin yokluğunda rtTA ve Otet dizileri arasındaki doğal bağlanma potansiyelinin ve rtTA’nın yokluğunda Otet transgeninin artık aktivitesinin bir sonucu olarak ortaya çıkar (^34’te gözden geçirilmiştir). Sızdıran ifade, Tet sistemlerinin bir zayıflığını temsil eder ve sızıntı genellikle sistem için kabul edilebilir bir dezavantaj olmasına rağmen, sızdıran ifadenin Otet-DTA hayvanlarında dipteri toksini (DTA) gibi toksisiteye ve mortaliteye yol açabileceği durumlar bu sistemlerin kullanımını sınırlayabilir³⁵.

Mikroskopi için ince kesitlerin beyin işlemesi, bölümlenmesi ve immünofloresansı
Bir soy izleme deneyinden sonra farelerin beyinlerini analiz etmek için, fareler önce beyinde yüksek otofloresansa yol açabilecek kan ve CSF’yi çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yoluyla perfüze edilmelidir. Hayvanın perfüze edilebileceği yaygın olarak kullanılan iki fiksatif vardır: Histochoice Doku Fiksatifi, glioksal fiksatif (GF) veya% 4 paraformaldehit (PFA). Glioksal fiksatörler, PFA’dan daha az çapraz bağlama ile nispeten yumuşak bir fiksasyon işlemine izin verir. Bu, doku sertliğini azaltır, antijen alma ihtiyacını azaltır ve immün boyama sırasında daha az konsantre antikor çözeltilerine izin verir. Bununla birlikte, metanol içeriyorsa, bu otofloresan^36’yı arttırmaya hizmet edebilir. Öte yandan, PFA genellikle daha sağlam bir fiksasyona izin verecektir ve immün boyama sırasında antijen geri kazanımı gerekli olsa da, sadece PFA ile sabitlenmiş dokularla çalışacak antikorlar vardır ve% 4 PFA ile perfüzyon daha sonra açıklanan optik temizleme tekniği için gereklidir.

Perfüzyonu takiben, beyinlerin bir gecede perfüzyon sırasında kullanılan aynı fiksatif tipine daldırıldığı bir fiksasyon sonrası adımdır. Bu, perfüzyon sırasında tamamen sabitlenmemiş olabilecek beyin bölgelerinin düzeltilmeye devam etmesini sağlar. Daha sonra, beyinler, doku içinde buz oluşumunu önlemek için donma adımından önce mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sakkarozda inkübe edilecektir (“kriyo-koruma”). Beyinler daha sonra işlenmek üzere herhangi bir sayıda sagital, koronal veya enine doku bölümüne kesilebilir. Hem hassasiyet hem de tekrarlanabilirlik için, kalibre edilmiş beyin bloklarının hayvanlar arasında tutarlı bregma kesimleri sağlayacak şekilde kullanılması gerekir. Beyinlerin nasıl bölümlendiğini etkileyebilecek en önemli faktör, ilgilenilen beyin bölgeleridir. Örneğin, bir sagital kesim bir doku bölümünde daha fazla beyin bölgesinin analiz edilmesine izin verebilirken, bu kesim ventriküler-subventriküler bölgenin (V-SVZ) nöro / gliojenik bölgelerinin analizine izin vermeyecektir, çünkü lateral ventrikülün lateral ve medial taraflarının bu boyutta ayırt edilmesi imkansız olacaktır ve koronal düzlemde daha iyi gözlenir. Bu, yetişkin nörogenez çalışmalarında yapılması gereken önemli bir ayrım olabilir, çünkü lateral ventrikülün lateral tarafı nörojenik V-SVZ’yi içerirken, lateral ventrikülün medial duvarı daha gliojenik bir niş^37’dir.

Dokular koronal, sagital veya enine bölümlere ayrıldıktan sonra, Optimum Soğutma Sıcaklığı (OCT) gömme çözeltisi kullanılarak bloklar halinde dondurulacaktır. Burada, beyinler kuru buz ve etanol karışımı kullanılarak bu gömme malzemesi içinde dondurulur. İnce kesit analizi gerekiyorsa, bloklar bir kriyostat üzerinde dilimlenir ve gerekli aşağı akış analizine bağlı olarak pozitif yüklü cam slaytlara ince kesitler (<20 μm) olarak yapıştırılabilir. Şarj edilmemiş cam slaytlar da kullanılabilir, ancak yüksüz slaytların kullanılması, dokuların slaytlardan yapışmasına neden olabilir³⁸. Orta kalınlıkta serbest yüzen doku kesitleri (>20 μm) gerekiyorsa, dokular serbest yüzen kesitler halinde toplanacaktır. Kalın kesitler (0.5-4 mm) gerekiyorsa, dondurulmamış beyin bölümlerinin bir vibratom ile dilimlenmesi gerekir. Slaytlardaki -20 ila -80 °C’de donma gerektiren bölümler ile 4 °C’de saklanacak serbest yüzen bölümler arasındaki depolama farklılıklarına dikkat etmek önemlidir.

Beyin temizleme ve tüm montaj immünofloresan konfokal mikroskopi
Fare beynindeki soy izlenen hücrelerin daha geniş, ancak daha az ayrıntılı bir analizi istenirse, iDISCO beyin temizleme³⁹ ve ardından immün boyama ve fayanslı z-yığını konfokal mikroskopi veya ışık tabakası mikroskobu ile beyin dokusunun daha kalın segmentlerinin kapsamlı bir analizi mümkündür. Burada, fare beyninin büyük bölümleri optik olarak temizlenecek (bir delipidasyon süreci³⁹), bu da 1 mm’lik bir doku bölümünde floresan sinyal görüntülemeye daha iyi izin verecektir. Bu işlemin dezavantajları, yüksek otofloresan ve daha geleneksel yöntemlerle (ince kriyozasyonlar veya serbest yüzen kesitler) karşılaştırıldığında gereken artan çalışma mesafeleri nedeniyle hücre morfolojisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme yeteneğinin azalması ve ayrıntılı birlikte boyama analizidir. Bu nedenle, tek tek hücreleri karakterize etmeye veya analiz etmeye çalışmak yerine, birden fazla beyin bölgesinde büyük ölçekli soy izleme sonuçlarını analiz etmek için beyin temizlemeyi öneriyoruz.