Summary

Прослеживание линии индуцируемых флуоресцентно меченых стволовых клеток в мозге взрослой мыши

Published: May 20, 2022
doi:

Summary

Способность постоянно маркировать стволовые клетки и их потомство флуорофором с использованием индуцируемой трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, позволяет проводить пространственный и временной анализ активации, пролиферации, миграции и / или дифференцировки in vivo. Трассировка родословной может выявить новую информацию о приверженности линии, реакции на вмешательство (вмешательства) и мультипотентности.

Abstract

Линия обратной транскриптазы теломеразы (Tert) была разработана для исследования поведения и судьбы взрослых тканевых стволовых клеток путем пересечения системы «Tet-On» oTet-Cre мыши с новым трансгеном обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), связанным с промотором Трета, который, как мы продемонстрировали, отмечает новую популяцию взрослых стволовых клеток мозга. Здесь введение тетрациклинового производного доксициклина мышам mTert-rtTA::oTet-Cre позволит неизгладимо отметить популяцию клеток, экспрессирующих 4,4 кб фрагмента промоторной области гена Tert. При объединении репортера Rosa-mTmG мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG будут экспрессировать мембранный tdTomato (mTomato) до тех пор, пока лечение доксициклином не вызовет замену экспрессии mTomato мембраной EGFP (mGFP) в клетках, которые также экспрессируют Tert. Поэтому, когда эти мыши с тройной трансгенной линией, отслеживающие линию, получают доксициклин («импульсный» период, в течение которого отмечаются TERT-экспрессирующие клетки), эти клетки станут неизгладимо маркированными клетками mGFP+, которые можно отслеживать в течение любого желаемого периода времени после удаления доксициклина («период погони»), даже если экспрессия Tert впоследствии теряется. Затем мозг фиксируется перфузией и обрабатывается для иммунофлуоресценции и других последующих применений, чтобы интерпретировать изменения в активации стволовых клеток, пролиферации, приверженности родословной, миграции в различные ниши мозга и дифференцировки к зрелым типам клеток. Используя эту систему, любая мышь rtTA может быть соединена с oTet-Cre и репортером Rosa для проведения экспериментов по отслеживанию линий с использованием маркеров стволовых клеток, индуцируемых доксициклином.

Introduction

Значение линии мыши трассировки линии
Анализ стволовых клеток in vivo может быть затруднен, поскольку многие анализы, которые исследуют такие клетки, сосредоточены только на характеристике этих клеток в момент смерти животного, что представляет собой конечный снимок во времени. Чтобы лучше понять процессы пролиферации, дифференцировки и миграции предшественников, промежуточных / переходных типов клеток и зрелых клеток с течением времени, требуется подход продольного анализа. Это может быть достигнуто с помощью исследований трассировки линии, в результате которых стволовые /прогениторные клетки маркируются неизгладимо и могут отслеживаться в течение любого периода времени после1.

В мозге взрослых млекопитающих процесс нейрогенеза, посредством которого взрослые нейроны создаются из стволовых и прогениторных клеток, был впервые проанализирован путем удержания меток тимидином-Н3 2,3,4 или 5-бром-2′-дезоксиуридином (BrdU)5,6,7,8 . В этих исследованиях пролиферативные клетки были отмечены аналогом тимина, который был включен в ДНК клеток во время репликации и деления/пролиферации клеток. Отмеченные клетки, а также их потомство, следовательно, содержали этот аналог, который затем был идентифицирован посмертно. Однако, в то время как тимидин-Н3 и BrdU позволяли маркировать пролиферативные клетки и их потомство в областях мозга, где стволовые клетки были плохо изучены, этим исследованиям препятствовали недостатки этих инструментов. Тимидин-Н3 индуцирует остановку клеточного цикла, апоптоз и дозозависимое ингибирование синтеза ДНК9, в то время как BrdU маркирует клетки на различных уровнях в зависимости от пути введения10 и поглощается клетками во время репарации или апоптоза, а также во время деления клеток11. В последнее время используются более эффективные методы маркировки, такие как маркировка 5-этинил-2′-дезоксиуридином (EdU), но многие из тех же проблем, что и BrdU, все еще остаются12. Эти подходы также ограничиваются тем, что они отмечают любую пролиферативную клетку, а не только стволовые клетки, и, таким образом, интерпретация результатов может быть сбита с толку. В нейрогенной линии все стволовые и прогениторные клетки сохраняют митотическую способность, и только терминальные/зрелые нейроны не являются пролиферативными. Для астроцитов и микроглии, но не олигодендроцитов, пролиферация сохраняется неопределеннодолго 13,14,15.

Трансгенные мыши, используемые для отслеживания только клеток, которые экспрессируют интересующий белок, например, подтвержденный для идентификации взрослых стволовых клеток, как мы используем здесь, поэтому стали более распространенными при исследовании стволовых клеток и их потомства. Несмотря на то, что их трудно генерировать с помощью мышиных трансгенных подходов, линии отслеживания линий мыши позволяют отслеживать специфически отмеченные клетки в мозге и не полагаются только на пролиферацию. В трансгенной мышиной системе Tet-On введение тетрациклина или доксициклина (производного тетрациклина) индуцирует экспрессию cre-рекомбиназы в клетках, которые были спроектированы с помощью обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), который транскрибируется интересующим промотором. Тет-индуцируемая Cre-управляемая рекомбинация затем активирует экспрессию несмываемого флуоресцентного или люминесцентного белка в интересующих клетках, в зависимости от используемой мыши Rosa-reporter. Эти неизгладимо отмеченные клетки продолжают экспрессировать этот репортер после деления, дифференцировки или миграции, что позволяет отслеживать эти клетки и их потомство с течением времени или после различных вмешательств16. Преимущества трансгенных подходов к отслеживанию линий включают: 1) специфичность отслеживания конкретной клеточной линии или предшественника/стволовой клетки, отмеченной rtTA, 2) несмываемую экспрессию флуоресцентного или люминесцентного белка, несмотря на клеточный оборот или дифференцировку, 3) низкую токсичность, 4) условную активацию в любой точке жизненного цикла животного и 5) простоту использования с общими анализами, включая иммуноокрашивание/иммунофлуоресценцию16.

Другие методы индуцируемых во времени репортерных инструментов у мышей включают использование мышей Cre-ERT2, которые могут быть сопряжены с ROSA-GFP, ROSA-mTmG или другими флуоресцентными репортерными трансгенами. У этих животных клеточно-специфический регуляторный элемент, такой как интересующая промоторная или энхансерная область, стимулирует выработку рекомбиназы Cre, которая может быть активирована только путем введения тамоксифена. В то время как мышиные линии Cre-ERT2 позволяют индукцию Cre в определенных клеточных линиях, существует множество знаний, подробно описывающих влияние тамоксифена на нейрогенез взрослых17,18. Кроме того, существует много управляемых ROSA флуоресцентных репортерных генов, которые могут быть использованы вместо GFP или mTmG, включая YFP или CFP, что позволит использовать альтернативную флуоресцентную маркировку в других флуоресцентных длинах волн. Эти флуоресцентные репортерные гены могут быть использованы с системами Tet-On или Cre-ERT2.

Теломеразная обратная транскриптаза (TERT) является ограничивающим скорость компонентом голофермента теломеразы, который работает для расширения теломер после их укорочения во время деления клеток19,20. TERT был идентифицирован как маркер взрослых тканевых стволовых клеток в кишечнике21,22, костном мозге21, печени23, жировойкислоте 24, эндометрии25,26 и кости 1. Является ли экспрессия TERT в этих взрослых стволовых клетках исключительно для активности, расширяющей теломеразу, или для выполнения неканонических ролейTERT 27, до сих пор неизвестно. TERT-экспрессирующие покоя взрослые стволовые клетки (qASCs) были идентифицированы и прослежены по всему телу с трансгенной линией, отслеживающей мышей, для изучения мультипотентности и самообновляющейся способности этих стволовых клеток, а также их способности активировать, пролиферировать, дифференцировать и мигрировать 1,22,23,28. Создание трансгена Tert-rtTA было выполнено ранее1. В этой статье мы опишем использование линии трассировки линии мыши TERT для изучения TERT + qASCs, которую мы идентифицировали как новую популяцию ASC в мозге взрослой мыши.

Генерация линии мыши трансгенной трассировки линий
Чтобы создать линию мыши с трассировкой линий с помощью системы Tet-On, три трансгена должны быть объединены в одно животное посредством спаривания мыши. Первый — ртТА, экспрессируемый под контролем промотора интересующего гена (наш — TERT-rtTA). Таким образом, в клетке, которая экспрессирует этот интересующий ген, rtTA будет экспрессироваться. Вторым является ген oTet-Cre, который содержит элемент ответа тетрациклина (TRE), который позволит транскрипцию рекомбиназы Cre в присутствии как транскрипта слияния rtTA, так и тетрациклина или доксициклина. Тетрациклин или доксициклин можно вводить животному через питьевую воду или чау29. Наконец, должен быть ген, который будет активирован расщеплением cre recombinase. В этой рукописи геном маркировки, который мы опишем, является ген Rosa26-mTmG, который до рекомбинации Cre будет повсеместно транскрибировать mTomato (мембранная красная флуоресценция во всех клетках). Однако, если клетка экспрессирует транскрипт rtTA и содержит тетрациклин или доксициклин, рекомбинация Cre набора участков lox P между сайтами mTomato и mGFP изменит сайт R26 и заставит клетку продуцировать мембранный EGFP (mGFP или мембранную зеленую флуоресценцию) вместо мембранного томата. Неизгладимый характер этого сигнала mGFP позволит in vivo маркировать и отслеживать клетки по мере их пролиферации, миграции и дифференцировки. Следуя следу, клетки могут быть проанализированы на экспрессию GFP посредством иммунофлуоресценции в стандартных криосекциях или более толстых оптически очищенных мозгах.

В этой статье мы опишем использование конкретной линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Чтобы создать эту тройную трансгенную линию мышей, мы сначала спарили животных oTet-Cre (штамм The Jackson Lab #006234) с животными Rosa-mTmG (штамм The Jackson Lab #007676), чтобы создать двойных трансгенных мышей oTet-Cre::Rosa-mTmG. Эти животные были генотипированы с праймерами и шаблонами ПЦР, указанными в дополнительных таблицах 1 и 2. Мышей mTert-rtTA (созданных Дэвидом Бро1) спаривали с животными oTet-Cre::Rosa-mTmG для создания мышей mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (рисунок 1A)1,30. Механизм действия линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG проиллюстрирован на рисунке 1B.

Конструкция индукции доксициклина и импульсной погони
При планировании экспериментов важно учитывать несколько факторов, которые будут влиять на исход экспериментов по отслеживанию родословной, в том числе возраст животного при индукции доксициклина, продолжительность введения доксициклина («импульсный» период), продолжительность времени после удаления доксициклина до сбора тканей («период погони») и сроки любых вмешательств во время этих процессов. Эти соображения дизайна исследования необходимы для понимания меченых клеток и их потомства в конце эксперимента. Первым шагом в процессе является определение возраста интереса животного и продолжительности введения доксициклина. Более длительные периоды импульса позволят большему количеству клеток экспрессировать промотор, связанный с rtTA, и большему количеству клеток, представляющих интерес, быть неизгладимо отмеченными. Тип клеток, который демонстрирует преходящую экспрессию интересующего гена, может потребовать более длительного импульсного периода, чем клетки, которые непрерывно экспрессируют интересующий ген. Однако, если целью исследования является понимание краткосрочных эффектов интересующей клетки или острого вмешательства, импульсный период не может быть слишком длинным, так как как только клетка отмечена, она будет прослежена через любое количество изменений в течение оставшейся части импульсного периода. В некоторых из наших исследований 2-дневный пульс без периода погони использовался для более точной имитации прямого репортера для TERT. Это связано с тем, что минимальная продолжительность времени для рекомбинации гена Rosa-mTmG составляет 2 дня31.

Следующим существенным периодом в эксперименте по погоне за пульсом является длина между удалением доксициклина и перфузией животного, также известная как «погоня». Период полувыведения доксициклина у мышей составляет примерно 170 минут независимо от пути введения, что позволяет сделать вывод о том, что индукция доксициклина, вероятно, больше не происходит через несколько часов после удаления32. Тем не менее, важно отметить, что метаболизм доксициклина медленнее у пожилых мышей, что может привести к более длительным эффективным «импульсным» периодам, чем у молодых животных33.

В течение периода погони меченые клетки будут по-прежнему маркироваться, даже после пролиферации, дифференцировки или миграции. Потомство этих клеток также будет помечено. Цель исследования будет определять длину парадигмы погони за пульсом. Если цель исследования состоит в том, чтобы понять регенерацию ткани в течение длительного периода времени с интересующими клетками, может потребоваться длительный период погони. Наконец, должны быть определены сроки любых вмешательств или лечения. Введение в течение импульсного периода будет влиять на клетки, экспрессирующие интересующий ген, а также на любое потомство, созданное в течение этого времени, тогда как введение в период погони может повлиять в основном на потомство интересующих клеток, хотя это будет зависеть от того, как быстро меченые клетки делятся или дифференцируются. Примеры экспериментальных конструкций с импульсным преследованием, которые мы использовали, описаны на рисунке 2А.

Также важно знать о возможности фонового сигнала GFP из-за протекающей экспрессии. Протекающая экспрессия возникает в результате присущего ей потенциала связывания между rtTA и последовательностями Otet в отсутствие доксициклина и остаточной активности трансгена Otet в отсутствие rtTA (рассмотрено в34). Протекающая экспрессия представляет собой одну из слабостей систем Тета, и хотя утечка часто является приемлемым недостатком системы, ситуации, когда протекающая экспрессия может привести к токсичности и смертности, например, при дифтерийном токсине (ДТА) у животных Otet-DTA, могут ограничить использование этих систем35.

Обработка мозга, сечение и иммунофлуоресценция тонких срезов для микроскопии
Чтобы проанализировать мозг мышей после эксперимента по отслеживанию родословной, мышей необходимо сначала перфузировать с помощью транскардиальной перфузии для удаления крови и ликвора, которые могут привести к высокой автофлуоресценции в мозге. Есть два широко используемых фиксатора, с помощью которых животное может быть перфузировано: Histochoice Tissue Fixative, глиоксальный фиксатор (GF) или 4% параформальдегид (PFA). Глиоксальные фиксаторы обеспечивают относительно мягкий процесс фиксации с меньшим количеством сшивок, чем PFA. Это уменьшает жесткость тканей, уменьшает потребность в извлечении антигена и позволяет использовать менее концентрированные растворы антител во время иммуноокрашивания. Однако, если они содержат метанол, это может служить для увеличения автофлуоресценции36. С другой стороны, PFA часто обеспечивает более надежную фиксацию, и хотя извлечение антигена потребуется во время иммуноокрашивания, существуют антитела, которые будут работать только с фиксированными тканями PFA, и перфузия с 4% PFA требуется для метода оптической очистки, описанного ниже.

Следующая перфузия является этапом пост-фиксации, на котором мозг погружается в тот же тип фиксатора, который используется во время перфузии в течение ночи. Это позволяет любым областям мозга, которые, возможно, не были полностью зафиксированы во время перфузии, продолжать фиксироваться. Затем мозг будет инкубирован в сахарозе в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), чтобы удалить как можно больше воды перед стадией замораживания, чтобы предотвратить образование льда в ткани («крио-сохранение»). Затем мозг может быть разрезан на любое количество сагиттальных, корональных или поперечных участков ткани для обработки. Как для точности, так и для воспроизводимости, калиброванные мозговые блоки должны использоваться таким образом, чтобы обеспечить последовательные порезы брегмы между животными. Наиболее важным фактором, который может повлиять на то, как разделен мозг, является область (области) мозга, представляющая интерес. Например, в то время как сагиттальный разрез может позволить анализировать больше областей мозга в одном участке ткани, этот разрез не позволит проанализировать нейро/глиогенные области желудочково-субвентрикулярной зоны (V-SVZ), поскольку боковые и медиальные стороны бокового желудочка будет невозможно различить в этом измерении и лучше наблюдать в корональной плоскости. Это может быть важным различием в исследованиях нейрогенеза взрослых, поскольку боковая сторона бокового желудочка содержит нейрогенный V-SVZ, в то время как медиальная стенка бокового желудочка является более глиогенной нишей37.

После того, как ткани были разделены на корональный, сагиттальный или поперечный срезы, они будут заморожены в блоки с использованием раствора для встраивания с оптимальной температурой охлаждения (OCT). Здесь мозг замораживается в этом встраиваемом материале с использованием смеси сухого льда и этанола. Если требуется анализ тонкого сечения, блоки будут нарезаны на криостате и, в зависимости от требуемого последующего анализа, могут быть прикреплены к положительно заряженным стеклянным слайдам в виде тонких срезов (<20 мкм). Стеклянные слайды, которые не заряжены, также могут быть использованы, но использование незаряженных слайдов может привести к тому, что ткани отклеятся от слайдов38. Если требуются свободно плавающие участки тканей средней толщины (>20 мкм), ткани будут собраны в виде свободно плавающих секций. Если требуются толстые срезы (0,5-4 мм), требуется нарезка незамороженных участков мозга вибратомом. Важно отметить различия в хранении между секциями на слайдах, которые требуют замораживания при -20 – -80 °C и свободно плавающими секциями, которые будут храниться при 4 °C.

Очистка мозга и цельная иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Если требуется более широкий, но менее подробный анализ клеток с прослеживаемой линией в мозге мыши, возможен комплексный анализ более толстых сегментов ткани мозга с очисткой мозга iDISCO39 с последующим иммуноокрашиванием и мозаичной конфокальной микроскопией z-стека или световой микроскопией. Здесь большие участки мозга мыши будут оптически очищены (процесс делипидации39), что лучше позволяет получать флуоресцентную визуализацию сигнала на участке ткани 1 мм. Недостатками этого процесса являются высокая автофлуоресценция и уменьшенная способность получать изображения морфологии клеток с высоким разрешением и подробный анализ совместного окрашивания из-за увеличения рабочих расстояний, требуемых по сравнению с более традиционными методами (тонкие криосекции или свободно плавающие участки). По этой причине мы рекомендуем очищать мозг для анализа крупномасштабных результатов отслеживания линий в нескольких областях мозга, вместо того, чтобы пытаться охарактеризовать или проанализировать отдельные клетки.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Огайо. 1. Создание линии прослеживания линии мыши Тет-Он, стратегии размножения и генотипирования для экспериментальной когорты мы?…

Representative Results

В то время как флуоресцентный сигнал, полученный от системы Tet-On с флуоресцентным репортером, будет варьироваться в зависимости от интересующего промотора и используемого флуорофора (флуорофоров), мы опишем, как результаты были проанализированы с животными mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Анализ моз…

Discussion

Описан метод создания, использования и анализа тройной трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, отмечающую стволовые клетки в мозге взрослой мыши in vivo. В сочетании с иммуноокрашиванием или очисткой мозга может быть выполнена идентификация и характеристика прослеживаемых фл…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Диану Карлоне (Бостонская детская больница, Гарвардская медицинская школа) и д-ра Мэтью Лайнса (Центр диабета Джослина; Научно-исследовательский институт Медицинского центра штата Мэн) для руководства с использованием животных mTert-rtTA.

Materials

Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

References

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
  6. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  7. Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
  8. Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
  9. Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
  10. Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
  11. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  12. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  13. Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G. Measurements of astrocyte proliferation. Methods in Molecular Biology. 758, 349-359 (2011).
  14. Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
  15. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  16. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
  17. Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
  18. Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
  19. Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
  20. Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
  21. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  22. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
  23. Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
  24. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
  25. Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
  26. Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
  27. Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
  28. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
  29. Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
  30. Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
  31. Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  32. Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
  33. Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
  34. Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
  35. Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
  36. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
  37. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  38. Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , 67-73 (2010).
  39. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  40. Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
  41. Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
  42. Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
  43. Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
  44. Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
  45. Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
  46. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
  47. Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G. Calretinin-immunoreactive neurons in the human striatum. Brain Research. 674 (2), 347-351 (1995).
  48. Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
  49. Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
  50. Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -., Lopez-Mascaraque, L. -. Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
  51. Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
  52. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
  53. Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
  54. Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
  55. Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  56. Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
  57. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
  58. Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  59. Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
  60. DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
  61. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).

Play Video

Cite This Article
Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

View Video