Прослеживание линии индуцируемых флуоресцентно меченых стволовых клеток в мозге взрослой мыши

Значение линии мыши трассировки линии
Анализ стволовых клеток in vivo может быть затруднен, поскольку многие анализы, которые исследуют такие клетки, сосредоточены только на характеристике этих клеток в момент смерти животного, что представляет собой конечный снимок во времени. Чтобы лучше понять процессы пролиферации, дифференцировки и миграции предшественников, промежуточных / переходных типов клеток и зрелых клеток с течением времени, требуется подход продольного анализа. Это может быть достигнуто с помощью исследований трассировки линии, в результате которых стволовые /прогениторные клетки маркируются неизгладимо и могут отслеживаться в течение любого периода времени после¹.

В мозге взрослых млекопитающих процесс нейрогенеза, посредством которого взрослые нейроны создаются из стволовых и прогениторных клеток, был впервые проанализирован путем удержания меток тимидином-Н^{3 2,3,4} или 5-бром-2′-дезоксиуридином (BrdU)^5,6,7,8 . В этих исследованиях пролиферативные клетки были отмечены аналогом тимина, который был включен в ДНК клеток во время репликации и деления/пролиферации клеток. Отмеченные клетки, а также их потомство, следовательно, содержали этот аналог, который затем был идентифицирован посмертно. Однако, в то время как тимидин-Н3 и BrdU позволяли маркировать пролиферативные клетки и их потомство в областях мозга, где стволовые клетки были плохо изучены, этим исследованиям препятствовали недостатки этих инструментов. Тимидин-Н3 индуцирует остановку клеточного цикла, апоптоз и дозозависимое ингибирование синтеза ДНК⁹, в то время как BrdU маркирует клетки на различных уровнях в зависимости от пути введения¹⁰ и поглощается клетками во время репарации или апоптоза, а также во время деления клеток¹¹. В последнее время используются более эффективные методы маркировки, такие как маркировка 5-этинил-2′-дезоксиуридином (EdU), но многие из тех же проблем, что и BrdU, все еще остаются¹². Эти подходы также ограничиваются тем, что они отмечают любую пролиферативную клетку, а не только стволовые клетки, и, таким образом, интерпретация результатов может быть сбита с толку. В нейрогенной линии все стволовые и прогениторные клетки сохраняют митотическую способность, и только терминальные/зрелые нейроны не являются пролиферативными. Для астроцитов и микроглии, но не олигодендроцитов, пролиферация сохраняется неопределенно^долго 13,14,15.

Трансгенные мыши, используемые для отслеживания только клеток, которые экспрессируют интересующий белок, например, подтвержденный для идентификации взрослых стволовых клеток, как мы используем здесь, поэтому стали более распространенными при исследовании стволовых клеток и их потомства. Несмотря на то, что их трудно генерировать с помощью мышиных трансгенных подходов, линии отслеживания линий мыши позволяют отслеживать специфически отмеченные клетки в мозге и не полагаются только на пролиферацию. В трансгенной мышиной системе Tet-On введение тетрациклина или доксициклина (производного тетрациклина) индуцирует экспрессию cre-рекомбиназы в клетках, которые были спроектированы с помощью обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), который транскрибируется интересующим промотором. Тет-индуцируемая Cre-управляемая рекомбинация затем активирует экспрессию несмываемого флуоресцентного или люминесцентного белка в интересующих клетках, в зависимости от используемой мыши Rosa-reporter. Эти неизгладимо отмеченные клетки продолжают экспрессировать этот репортер после деления, дифференцировки или миграции, что позволяет отслеживать эти клетки и их потомство с течением времени или после различных вмешательств¹⁶. Преимущества трансгенных подходов к отслеживанию линий включают: 1) специфичность отслеживания конкретной клеточной линии или предшественника/стволовой клетки, отмеченной rtTA, 2) несмываемую экспрессию флуоресцентного или люминесцентного белка, несмотря на клеточный оборот или дифференцировку, 3) низкую токсичность, 4) условную активацию в любой точке жизненного цикла животного и 5) простоту использования с общими анализами, включая иммуноокрашивание/иммунофлуоресценцию¹⁶.

Другие методы индуцируемых во времени репортерных инструментов у мышей включают использование мышей Cre-ERT2, которые могут быть сопряжены с ROSA-GFP, ROSA-mTmG или другими флуоресцентными репортерными трансгенами. У этих животных клеточно-специфический регуляторный элемент, такой как интересующая промоторная или энхансерная область, стимулирует выработку рекомбиназы Cre, которая может быть активирована только путем введения тамоксифена. В то время как мышиные линии Cre-ERT2 позволяют индукцию Cre в определенных клеточных линиях, существует множество знаний, подробно описывающих влияние тамоксифена на нейрогенез взрослых^17,18. Кроме того, существует много управляемых ROSA флуоресцентных репортерных генов, которые могут быть использованы вместо GFP или mTmG, включая YFP или CFP, что позволит использовать альтернативную флуоресцентную маркировку в других флуоресцентных длинах волн. Эти флуоресцентные репортерные гены могут быть использованы с системами Tet-On или Cre-ERT2.

Теломеразная обратная транскриптаза (TERT) является ограничивающим скорость компонентом голофермента теломеразы, который работает для расширения теломер после их укорочения во время деления клеток^19,20. TERT был идентифицирован как маркер взрослых тканевых стволовых клеток в кишечнике^21,22, костном мозге²¹, печени²³, жировой^{кислоте 24}, эндометрии^25,26 и кости 1. Является ли экспрессия TERT в этих взрослых стволовых клетках исключительно для активности, расширяющей теломеразу, или для выполнения неканонических ролей^{TERT 27}, до сих пор неизвестно. TERT-экспрессирующие покоя взрослые стволовые клетки (qASCs) были идентифицированы и прослежены по всему телу с трансгенной линией, отслеживающей мышей, для изучения мультипотентности и самообновляющейся способности этих стволовых клеток, а также их способности активировать, пролиферировать, дифференцировать и мигрировать 1,22,23,28. Создание трансгена Tert-rtTA было выполнено ранее¹. В этой статье мы опишем использование линии трассировки линии мыши TERT для изучения TERT + qASCs, которую мы идентифицировали как новую популяцию ASC в мозге взрослой мыши.

Генерация линии мыши трансгенной трассировки линий
Чтобы создать линию мыши с трассировкой линий с помощью системы Tet-On, три трансгена должны быть объединены в одно животное посредством спаривания мыши. Первый — ртТА, экспрессируемый под контролем промотора интересующего гена (наш — TERT-rtTA). Таким образом, в клетке, которая экспрессирует этот интересующий ген, rtTA будет экспрессироваться. Вторым является ген oTet-Cre, который содержит элемент ответа тетрациклина (TRE), который позволит транскрипцию рекомбиназы Cre в присутствии как транскрипта слияния rtTA, так и тетрациклина или доксициклина. Тетрациклин или доксициклин можно вводить животному через питьевую воду или чау²⁹. Наконец, должен быть ген, который будет активирован расщеплением cre recombinase. В этой рукописи геном маркировки, который мы опишем, является ген Rosa26-mTmG, который до рекомбинации Cre будет повсеместно транскрибировать mTomato (мембранная красная флуоресценция во всех клетках). Однако, если клетка экспрессирует транскрипт rtTA и содержит тетрациклин или доксициклин, рекомбинация Cre набора участков lox P между сайтами mTomato и mGFP изменит сайт R26 и заставит клетку продуцировать мембранный EGFP (mGFP или мембранную зеленую флуоресценцию) вместо мембранного томата. Неизгладимый характер этого сигнала mGFP позволит in vivo маркировать и отслеживать клетки по мере их пролиферации, миграции и дифференцировки. Следуя следу, клетки могут быть проанализированы на экспрессию GFP посредством иммунофлуоресценции в стандартных криосекциях или более толстых оптически очищенных мозгах.

В этой статье мы опишем использование конкретной линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Чтобы создать эту тройную трансгенную линию мышей, мы сначала спарили животных oTet-Cre (штамм The Jackson Lab #006234) с животными Rosa-mTmG (штамм The Jackson Lab #007676), чтобы создать двойных трансгенных мышей oTet-Cre::Rosa-mTmG. Эти животные были генотипированы с праймерами и шаблонами ПЦР, указанными в дополнительных таблицах 1 и 2. Мышей mTert-rtTA (созданных Дэвидом Бро¹) спаривали с животными oTet-Cre::Rosa-mTmG для создания мышей mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (рисунок 1A)^1,30. Механизм действия линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG проиллюстрирован на рисунке 1B.

Конструкция индукции доксициклина и импульсной погони
При планировании экспериментов важно учитывать несколько факторов, которые будут влиять на исход экспериментов по отслеживанию родословной, в том числе возраст животного при индукции доксициклина, продолжительность введения доксициклина («импульсный» период), продолжительность времени после удаления доксициклина до сбора тканей («период погони») и сроки любых вмешательств во время этих процессов. Эти соображения дизайна исследования необходимы для понимания меченых клеток и их потомства в конце эксперимента. Первым шагом в процессе является определение возраста интереса животного и продолжительности введения доксициклина. Более длительные периоды импульса позволят большему количеству клеток экспрессировать промотор, связанный с rtTA, и большему количеству клеток, представляющих интерес, быть неизгладимо отмеченными. Тип клеток, который демонстрирует преходящую экспрессию интересующего гена, может потребовать более длительного импульсного периода, чем клетки, которые непрерывно экспрессируют интересующий ген. Однако, если целью исследования является понимание краткосрочных эффектов интересующей клетки или острого вмешательства, импульсный период не может быть слишком длинным, так как как только клетка отмечена, она будет прослежена через любое количество изменений в течение оставшейся части импульсного периода. В некоторых из наших исследований 2-дневный пульс без периода погони использовался для более точной имитации прямого репортера для TERT. Это связано с тем, что минимальная продолжительность времени для рекомбинации гена Rosa-mTmG составляет 2 дня³¹.

Следующим существенным периодом в эксперименте по погоне за пульсом является длина между удалением доксициклина и перфузией животного, также известная как «погоня». Период полувыведения доксициклина у мышей составляет примерно 170 минут независимо от пути введения, что позволяет сделать вывод о том, что индукция доксициклина, вероятно, больше не происходит через несколько часов после удаления³². Тем не менее, важно отметить, что метаболизм доксициклина медленнее у пожилых мышей, что может привести к более длительным эффективным «импульсным» периодам, чем у молодых животных³³.

В течение периода погони меченые клетки будут по-прежнему маркироваться, даже после пролиферации, дифференцировки или миграции. Потомство этих клеток также будет помечено. Цель исследования будет определять длину парадигмы погони за пульсом. Если цель исследования состоит в том, чтобы понять регенерацию ткани в течение длительного периода времени с интересующими клетками, может потребоваться длительный период погони. Наконец, должны быть определены сроки любых вмешательств или лечения. Введение в течение импульсного периода будет влиять на клетки, экспрессирующие интересующий ген, а также на любое потомство, созданное в течение этого времени, тогда как введение в период погони может повлиять в основном на потомство интересующих клеток, хотя это будет зависеть от того, как быстро меченые клетки делятся или дифференцируются. Примеры экспериментальных конструкций с импульсным преследованием, которые мы использовали, описаны на рисунке 2А.

Также важно знать о возможности фонового сигнала GFP из-за протекающей экспрессии. Протекающая экспрессия возникает в результате присущего ей потенциала связывания между rtTA и последовательностями Otet в отсутствие доксициклина и остаточной активности трансгена Otet в отсутствие rtTA (рассмотрено в³⁴). Протекающая экспрессия представляет собой одну из слабостей систем Тета, и хотя утечка часто является приемлемым недостатком системы, ситуации, когда протекающая экспрессия может привести к токсичности и смертности, например, при дифтерийном токсине (ДТА) у животных Otet-DTA, могут ограничить использование этих систем³⁵.

Обработка мозга, сечение и иммунофлуоресценция тонких срезов для микроскопии
Чтобы проанализировать мозг мышей после эксперимента по отслеживанию родословной, мышей необходимо сначала перфузировать с помощью транскардиальной перфузии для удаления крови и ликвора, которые могут привести к высокой автофлуоресценции в мозге. Есть два широко используемых фиксатора, с помощью которых животное может быть перфузировано: Histochoice Tissue Fixative, глиоксальный фиксатор (GF) или 4% параформальдегид (PFA). Глиоксальные фиксаторы обеспечивают относительно мягкий процесс фиксации с меньшим количеством сшивок, чем PFA. Это уменьшает жесткость тканей, уменьшает потребность в извлечении антигена и позволяет использовать менее концентрированные растворы антител во время иммуноокрашивания. Однако, если они содержат метанол, это может служить для увеличения автофлуоресценции³⁶. С другой стороны, PFA часто обеспечивает более надежную фиксацию, и хотя извлечение антигена потребуется во время иммуноокрашивания, существуют антитела, которые будут работать только с фиксированными тканями PFA, и перфузия с 4% PFA требуется для метода оптической очистки, описанного ниже.

Следующая перфузия является этапом пост-фиксации, на котором мозг погружается в тот же тип фиксатора, который используется во время перфузии в течение ночи. Это позволяет любым областям мозга, которые, возможно, не были полностью зафиксированы во время перфузии, продолжать фиксироваться. Затем мозг будет инкубирован в сахарозе в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), чтобы удалить как можно больше воды перед стадией замораживания, чтобы предотвратить образование льда в ткани («крио-сохранение»). Затем мозг может быть разрезан на любое количество сагиттальных, корональных или поперечных участков ткани для обработки. Как для точности, так и для воспроизводимости, калиброванные мозговые блоки должны использоваться таким образом, чтобы обеспечить последовательные порезы брегмы между животными. Наиболее важным фактором, который может повлиять на то, как разделен мозг, является область (области) мозга, представляющая интерес. Например, в то время как сагиттальный разрез может позволить анализировать больше областей мозга в одном участке ткани, этот разрез не позволит проанализировать нейро/глиогенные области желудочково-субвентрикулярной зоны (V-SVZ), поскольку боковые и медиальные стороны бокового желудочка будет невозможно различить в этом измерении и лучше наблюдать в корональной плоскости. Это может быть важным различием в исследованиях нейрогенеза взрослых, поскольку боковая сторона бокового желудочка содержит нейрогенный V-SVZ, в то время как медиальная стенка бокового желудочка является более глиогенной нишей³⁷.

После того, как ткани были разделены на корональный, сагиттальный или поперечный срезы, они будут заморожены в блоки с использованием раствора для встраивания с оптимальной температурой охлаждения (OCT). Здесь мозг замораживается в этом встраиваемом материале с использованием смеси сухого льда и этанола. Если требуется анализ тонкого сечения, блоки будут нарезаны на криостате и, в зависимости от требуемого последующего анализа, могут быть прикреплены к положительно заряженным стеклянным слайдам в виде тонких срезов (<20 мкм). Стеклянные слайды, которые не заряжены, также могут быть использованы, но использование незаряженных слайдов может привести к тому, что ткани отклеятся от слайдов³⁸. Если требуются свободно плавающие участки тканей средней толщины (>20 мкм), ткани будут собраны в виде свободно плавающих секций. Если требуются толстые срезы (0,5-4 мм), требуется нарезка незамороженных участков мозга вибратомом. Важно отметить различия в хранении между секциями на слайдах, которые требуют замораживания при -20 – -80 °C и свободно плавающими секциями, которые будут храниться при 4 °C.

Очистка мозга и цельная иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Если требуется более широкий, но менее подробный анализ клеток с прослеживаемой линией в мозге мыши, возможен комплексный анализ более толстых сегментов ткани мозга с очисткой мозга iDISCO³⁹ с последующим иммуноокрашиванием и мозаичной конфокальной микроскопией z-стека или световой микроскопией. Здесь большие участки мозга мыши будут оптически очищены (процесс делипидации³⁹), что лучше позволяет получать флуоресцентную визуализацию сигнала на участке ткани 1 мм. Недостатками этого процесса являются высокая автофлуоресценция и уменьшенная способность получать изображения морфологии клеток с высоким разрешением и подробный анализ совместного окрашивания из-за увеличения рабочих расстояний, требуемых по сравнению с более традиционными методами (тонкие криосекции или свободно плавающие участки). По этой причине мы рекомендуем очищать мозг для анализа крупномасштабных результатов отслеживания линий в нескольких областях мозга, вместо того, чтобы пытаться охарактеризовать или проанализировать отдельные клетки.