Summary

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Published: May 20, 2022
doi:

Summary

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l’analisi spaziale e temporale dell’attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull’impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Abstract

Una linea di topo di tracciamento della trascrittasi inversa della telomerasi (Tert) è stata sviluppata per studiare il comportamento e il destino delle cellule staminali dei tessuti adulti, incrociando il sistema “Tet-On” oTet-Cre mouse con un nuovo transgene transattivatore inverso della tetraciclina (rtTA) collegato al promotore Tert, che abbiamo dimostrato segna una nuova popolazione di cellule staminali cerebrali adulte. Qui, la somministrazione del derivato tetraciclina doxiciclina a topi mTert-rtTA::oTet-Cre segnerà in modo indelebile una popolazione di cellule che esprimono un frammento di 4,4 kb della regione promotore del gene Tert. Quando combinato il reporter Rosa-mTmG, i topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG esprimeranno tdTomato di membrana (mTomato) fino a quando il trattamento con doxiciclina indurrà la sostituzione dell’espressione di mTomato con EGFP di membrana (mGFP) nelle cellule che esprimono anche Tert. Pertanto, quando questi topi di tracciamento del lignaggio triplo transgenico ricevono doxiciclina (il periodo di “impulso” durante il quale vengono marcate le cellule che esprimono TERT), queste cellule diventeranno cellule mGFP+ indelebilmente marcate, che possono essere monitorate per qualsiasi periodo di tempo desiderabile dopo la rimozione della doxiciclina (il periodo di “inseguimento”), anche se l’espressione di Tert viene successivamente persa. I cervelli vengono quindi fissati per perfusione ed elaborati per l’immunofluorescenza e altre applicazioni a valle al fine di interpretare i cambiamenti nell’attivazione delle cellule staminali, nella proliferazione, nell’impegno del lignaggio, nella migrazione a varie nicchie cerebrali e nella differenziazione verso tipi di cellule mature. Utilizzando questo sistema, qualsiasi topo rtTA può essere accoppiato a oTet-Cre e un reporter Rosa per condurre esperimenti di tracciamento del lignaggio “pulse-chase” inducibili dalla doxiciclina utilizzando marcatori di cellule staminali.

Introduction

Valore di una linea del mouse che traccia la discendenza
L’analisi delle cellule staminali in vivo può essere difficile poiché molti saggi che esaminano tali cellule si concentrano solo sulla caratterizzazione di queste cellule al momento della morte dell’animale, che rappresenta un’istantanea terminale nel tempo. Per comprendere meglio i processi di proliferazione, differenziazione e migrazione di progenitori, tipi di cellule intermedie / di transizione e cellule mature nel tempo, è necessario un approccio di analisi longitudinale. Ciò può essere ottenuto con studi di tracciamento del lignaggio in cui le cellule staminali / progenitrici sono contrassegnate in modo indelebile e possono essere seguite per qualsiasi periodo di tempo dopo1.

Nel cervello dei mammiferi adulti, il processo di neurogenesi mediante il quale i neuroni nati in età adulta vengono creati da cellule staminali e progenitrici è stato prima analizzato tramite ritenzione dell’etichetta con timidina-H3 2,3,4 o 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU)5,6,7,8 . In questi studi, le cellule proliferative sono state marcate con l’analogo della timina, che è stato incorporato nel DNA delle cellule durante la replicazione e la divisione / proliferazione cellulare. La cellula marcata, così come la loro progenie, conteneva quindi questo analogo, che è stato poi identificato post-mortem. Tuttavia, mentre la timidina-H3 e BrdU hanno permesso la marcatura delle cellule proliferative e della loro progenie nelle regioni del cervello in cui le cellule staminali erano poco conosciute, questi studi sono stati ostacolati dagli aspetti negativi di questi strumenti. La timidina-H3 induce l’arresto del ciclo cellulare, l’apoptosi e l’inibizione della sintesi del DNA dose-dipendente9, mentre BrdU segna le cellule a livelli variabili a seconda della via di somministrazione10 e viene assorbita dalle cellule durante la riparazione o l’apoptosi, nonché durante la divisione cellulare11. Di recente sono stati utilizzati metodi di etichettatura più efficienti, come l’etichettatura con 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU), ma molti degli stessi problemi di BrdU rimangono ancora12. Questi approcci sono anche limitanti in quanto marcano qualsiasi cellula proliferativa, non solo le cellule staminali, e quindi l’interpretazione dei risultati può essere confusa. Nel lignaggio neurogeno, tutte le cellule staminali e progenitrici mantengono la capacità mitotica e solo i neuroni terminali / maturi non sono proliferativi. Per gli astrociti e le microglia, ma non per gli oligodendrociti, la proliferazione viene mantenuta indefinitamente 13,14,15.

I topi transgenici usati per lignare tracciano solo le cellule che esprimono una proteina di interesse, come quella confermata per identificare le cellule staminali adulte come usiamo qui, sono quindi diventati più comuni quando si indagano le cellule staminali e la loro progenie. Sebbene difficili da generare attraverso approcci transgenici di topo, le linee di topo che tracciano il lignaggio consentono il tracciamento di cellule specificamente marcate nel cervello e non si basano solo sulla proliferazione. Nel sistema murino transgenico Tet-On, la somministrazione di tetraciclina o doxiciclina (un derivato della tetraciclina) induce l’espressione di Cre-ricombinasi in cellule che sono state ingegnerizzate con un transattivatore di tetracicline inversa (rtTA), che viene trascritto da un promotore di interesse. La ricombinazione cre-driven inducibile da Tet attiverà quindi l’espressione di una proteina fluorescente o luminescente indelebile nelle cellule di interesse, a seconda del topo Rosa-reporter impiegato. Queste cellule marcate in modo indelebile continuano ad esprimere questo reporter dopo la divisione, la differenziazione o la migrazione, consentendo il tracciamento di queste cellule e della loro progenie nel tempo o dopo diversi interventi16. I vantaggi degli approcci transgenici di tracciamento del lignaggio includono: 1) specificità del tracciamento su un particolare lignaggio cellulare o progenitore/cellula staminale contrassegnata dall’rtTA, 2) espressione indelebile della proteina fluorescente o luminescente nonostante il turnover o la differenziazione cellulare, 3) bassa tossicità, 4) attivazione condizionata durante qualsiasi punto del ciclo di vita dell’animale e 5) facilità d’uso con saggi comuni, compresa l’immunocolorazione/immunofluorescenza16.

Altri metodi di strumenti reporter temporalmente inducibili nei topi includono l’uso di topi Cre-ERT2, che possono essere abbinati a ROSA-GFP, ROSA-mTmG o altri transgeni reporter fluorescenti. In questi animali, un elemento regolatore cellulare specifico, come una regione di interesse promotore o potenziatore, guida la produzione di Cre ricombinasi, che può essere attivata solo attraverso la somministrazione di tamoxifene. Mentre le linee di topo Cre-ERT2 consentono l’induzione di Cre in linee cellulari specifiche, esiste una ricchezza di conoscenze che dettagliano gli effetti del tamoxifene sulla neurogenesi adulta17,18. Inoltre, esistono molti geni reporter fluorescenti guidati da ROSA che possono essere utilizzati al posto di GFP o mTmG, tra cui YFP o CFP, che consentirebbero l’etichettatura fluorescente alternata in altre lunghezze d’onda fluorescenti. Questi geni reporter fluorescenti possono essere utilizzati con i sistemi Tet-On o Cre-ERT2.

La trascrittasi inversa della telomerasi (TERT) è il componente limitante della teloemerasi oloenzimatica, che lavora per estendere i telomeri dopo che sono stati accorciati durante la divisione cellulare19,20. TERT è stato identificato come un marker di cellule staminali tissutali adulte nell’intestino21,22, midollo osseo21, fegato23, adiposo24, endometrio25,26 e osso1. Non è ancora noto se l’espressione di TERT in queste cellule staminali adulte sia esclusivamente per l’attività di estensione della telomerasi o per svolgere ruoli TERT non canonici27. Le cellule staminali adulte quiescenti che esprimono TERT (qASC) sono state identificate e tracciate in tutto il corpo con topi che tracciano il lignaggio transgenico per studiare la multipotenza e la capacità di auto-rinnovamento di queste cellule staminali, nonché il loro potenziale di attivare, proliferare, differenziare e migrare 1,22,23,28. La creazione del transgene Tert-rtTA è stata eseguita in precedenza1. In questo articolo, descriveremo l’uso di una linea di topo TERT che traccia il lignaggio per studiare TERT + qASC che abbiamo identificato come una nuova popolazione ASC nel cervello del topo adulto.

Generazione di una linea di topo che traccia il lignaggio transgenico
Per generare una linea di topo che traccia il lignaggio utilizzando il sistema Tet-On, tre transgeni devono essere combinati all’interno di un singolo animale attraverso l’accoppiamento del topo. Il primo è un rtTA, espresso sotto il controllo del promotore del gene di interesse (il nostro è TERT-rtTA). In una cellula che esprime questo gene di interesse, verrà quindi espressa la rtTA. Il secondo è un gene oTet-Cre, che contiene un elemento di risposta tetraciclina (TRE) che consentirà la trascrizione della cre ricombinasi in presenza sia di un trascritto di fusione rtTA che di tetraciclina o doxiciclina. Tetraciclina o doxiciclina possono essere somministrati a un animale tramite acqua potabile o chow29. Infine, ci deve essere un gene che verrà attivato dalla scissione della Cre ricombinasi. In questo manoscritto, il gene di etichettatura che descriveremo è il gene Rosa26-mTmG, che fino alla ricombinazione Cre trascriverà ubiquitariamente mTomato (fluorescenza rossa di membrana in tutte le cellule). Tuttavia, se una cellula esprime il trascritto rtTA e contiene tetraciclina o doxiciclina, la ricombinazione cre di un insieme di siti lox P tra i siti mTomato e mGFP cambierà il sito R26 e farà sì che la cellula produca EGFP di membrana (mGFP, o fluorescenza verde di membrana) invece del pomodoro di membrana. La natura indelebile di questo segnale mGFP consentirà l’etichettatura e il tracciamento in vivo delle cellule mentre proliferano, migrano e si differenziano. Seguendo la traccia, le cellule possono essere analizzate per l’espressione di GFP tramite immunofluorescenza in criosezioni standard o cervelli otticamente più spessi.

In questo articolo, descriveremo l’uso della linea specifica del mouse, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Per creare questa tripla linea di topi transgenici, abbiamo prima accoppiato animali oTet-Cre (ceppo Jackson Lab #006234) con animali Rosa-mTmG (ceppo Jackson Lab #007676) per creare topi transgenici doppi oTet-Cre::Rosa-mTmG. Questi animali sono stati genotipizzati con primer e modelli PCR indicati nelle tabelle supplementari 1 e 2. I topi mTert-rtTA (creati da David Breault1) sono stati accoppiati con animali oTet-Cre::Rosa-mTmG per creare topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (Figura 1A)1,30. Il meccanismo d’azione della linea del mouse mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG è illustrato nella Figura 1B.

Induzione della doxiciclina e design dell’inseguimento degli impulsi
Quando si pianificano esperimenti, è importante considerare diversi fattori che influenzeranno l’esito degli esperimenti di tracciamento del lignaggio, tra cui l’età dell’animale all’induzione della doxiciclina, la durata della somministrazione di doxiciclina (il periodo di “impulso”), il periodo di tempo dopo la rimozione della doxiciclina prima della raccolta dei tessuti (il periodo di “inseguimento”) e la tempistica di eventuali interventi durante questi processi. Queste considerazioni sul design dello studio sono essenziali per comprendere le cellule etichettate e la loro progenie alla conclusione dell’esperimento. Il primo passo nel processo è identificare l’età di interesse dell’animale e la durata della somministrazione di doxiciclina. Periodi di impulso più lunghi consentiranno di esprimere il potenziale per più cellule di esprimere il promotore legato all’rtTA e di contrassegnare in modo indelebile più cellule di interesse. Un tipo di cellula che mostra un’espressione transitoria del gene di interesse può richiedere un periodo di impulso più lungo rispetto alle cellule che esprimono continuamente il gene di interesse. Tuttavia, se l’obiettivo dello studio è comprendere gli effetti a breve termine della cellula di interesse o di un intervento acuto, il periodo di impulso non può essere troppo lungo, poiché una volta che una cellula è marcata, sarà tracciata attraverso un numero qualsiasi di cambiamenti durante il resto del periodo di impulso. In alcuni dei nostri studi, un impulso di 2 giorni senza periodo di inseguimento è stato utilizzato per imitare più da vicino un reporter diretto per TERT. Questo perché il periodo minimo di tempo per la ricombinazione del gene Rosa-mTmG è di 2 giorni31.

Il prossimo periodo essenziale in un esperimento di inseguimento a impulsi è la lunghezza tra la rimozione della doxiciclina e la perfusione dell’animale, nota anche come “inseguimento”. L’emivita della doxiciclina nei topi è di circa 170 minuti indipendentemente dalla via di somministrazione, consentendo la conclusione che l’induzione della doxiciclina probabilmente non si verifica più diverse ore dopo la rimozione32. Tuttavia, è importante notare che il metabolismo della doxiciclina è più lento nei topi anziani, il che può portare a periodi di “polso” efficaci più lunghi rispetto agli animali giovani33.

Durante il periodo di inseguimento, le cellule etichettate continueranno ad essere etichettate, anche dopo la proliferazione, la differenziazione o la migrazione. Anche la progenie di queste cellule sarà etichettata. L’obiettivo dello studio modellerà la lunghezza del paradigma dell’inseguimento degli impulsi. Se l’obiettivo dello studio è comprendere la rigenerazione di un tessuto per un lungo periodo di tempo con le cellule di interesse, può essere necessario un lungo periodo di inseguimento. Infine, devono essere decisi i tempi di eventuali interventi o trattamenti. La somministrazione durante il periodo di impulso influenzerà le cellule che esprimono il gene di interesse e qualsiasi progenie creata durante questo periodo, mentre la somministrazione durante il periodo di inseguimento può influenzare principalmente la progenie delle cellule di interesse, anche se questo dipenderà dalla velocità con cui le cellule etichettate si dividono o si differenziano. Esempi di progetti sperimentali di inseguimento a impulsi che abbiamo utilizzato sono descritti nella Figura 2A.

È anche importante essere consapevoli della possibilità di segnale GFP in background a causa dell’espressione che perde. L’espressione perdente si verifica a causa del potenziale di legame intrinseco tra rtTA e le sequenze di Otet in assenza di doxiciclina e dell’attività residua del transgene Otet in assenza di rtTA (esaminato in34). L’espressione permeabile rappresenta un punto debole dei sistemi Tet e, sebbene la perdita sia spesso un aspetto negativo accettabile per il sistema, le situazioni in cui l’espressione permeabile può portare a tossicità e mortalità, come con la tossina diptheria (DTA) negli animali Otet-DTA possono limitare l’uso di questi sistemi35.

Elaborazione cerebrale, sezionamento e immunofluorescenza di sezioni sottili per microscopia
Per analizzare il cervello dei topi dopo un esperimento di tracciamento del lignaggio, i topi devono prima essere perfusi tramite perfusione transcardica per rimuovere il sangue e il liquido cerebrospinale che possono portare ad un’elevata autofluorescenza nel cervello. Ci sono due fissativi comunemente usati con cui l’animale può essere perfuso: Histochoice Tissue Fixative, un glioxal fixative (GF) o 4% paraformaldeide (PFA). I fissativi gliossiali consentono un processo di fissazione relativamente delicato con meno reticolazione rispetto al PFA. Ciò riduce la rigidità dei tessuti, riduce la necessità di recupero dell’antigene e consente soluzioni anticorpali meno concentrate durante l’immunocolorazione. Tuttavia, se contengono metanolo questo può servire ad aumentare l’autofluorescenza36. D’altra parte, il PFA spesso consente una fissazione più robusta e, mentre il recupero dell’antigene sarà richiesto durante l’immunocolorazione, ci sono anticorpi che funzioneranno solo con tessuti fissati al PFA e la perfusione con PFA al 4% è necessaria per la tecnica di compensazione ottica descritta più avanti.

La perfusione successiva è una fase post-fissazione, in cui i cervelli sono immersi nello stesso tipo di fissativo utilizzato durante la perfusione durante la notte. Ciò consente a tutte le regioni del cervello che potrebbero non essere state completamente fissate durante la perfusione di continuare a riparare. Successivamente, i cervelli saranno incubati in saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere quanta più acqua possibile prima della fase di congelamento per prevenire la formazione di ghiaccio all’interno del tessuto (“crio-conservazione”). I cervelli possono quindi essere tagliati in qualsiasi numero di sezioni di tessuto sagittale, coronale o trasversale per l’elaborazione. Sia per la precisione che per la riproducibilità, i blocchi cerebrali calibrati devono essere utilizzati in modo da garantire tagli di bregma coerenti tra gli animali. Il fattore più importante che può influenzare il modo in cui i cervelli sono sezionati è la regione del cervello di interesse. Ad esempio, mentre un taglio sagittale può consentire di analizzare più regioni del cervello in una sezione di tessuto, questo taglio non consentirà l’analisi delle regioni neuro / gliogeniche della zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) poiché i lati laterale e mediale del ventricolo laterale saranno impossibili da discernere in quella dimensione e sono meglio osservati nel piano coronale. Questa può essere una distinzione importante da fare negli studi di neurogenesi adulta, poiché il lato laterale del ventricolo laterale contiene il V-SVZ neurogenico, mentre la parete mediale del ventricolo laterale è una nicchia più gliogenica37.

Dopo che i tessuti sono stati divisi in sezioni coronali, sagittali o trasversali, saranno congelati in blocchi utilizzando la soluzione di incorporamento della temperatura di raffreddamento ottimale (OCT). Qui, i cervelli sono congelati all’interno di questo materiale incorporante, con l’uso di una miscela di ghiaccio secco ed etanolo. Se è necessaria l’analisi a sezione sottile, i blocchi verranno tagliati su un criostato e, a seconda dell’analisi a valle richiesta, possono essere aderiti a vetrini caricati positivamente come sezioni sottili (<20 μm). Possono essere utilizzati anche vetrini che non sono carichi, ma l'uso di vetrini non caricati può comportare lo sblocco dei tessuti dalle diapositive38. Se sono necessarie sezioni di tessuto fluttuanti di medio spessore (>20 μm), i tessuti saranno raccolti come sezioni fluttuanti. Se sono necessarie sezioni spesse (0,5-4 mm), è necessario affettare sezioni cerebrali non congelate con un vibratoma. È importante notare le differenze di stoccaggio tra le sezioni sulle diapositive, che richiedono il congelamento a -20–80 °C e le sezioni fluttuanti, che saranno conservate a 4 °C.

Pulizia del cervello e microscopia confocale immunofluorescente a montaggio intero
Se si desidera un’analisi più ampia, ma meno dettagliata delle cellule tracciate nel lignaggio nel cervello del topo, è possibile un’analisi completa dei segmenti più spessi del tessuto cerebrale con iDISCObrain clearing 39 seguita da immunocolorazione e microscopia confocale z-stack piastrellata o microscopia a foglio luminoso. Qui, ampie sezioni del cervello del topo saranno cancellate otticamente (un processo di delipidazione39), che consente meglio l’imaging del segnale fluorescente su una sezione di tessuto di 1 mm. Gli svantaggi di questo processo sono l’elevata autofluorescenza e una ridotta capacità di ottenere immagini ad alta risoluzione della morfologia cellulare e un’analisi dettagliata della co-colorazione a causa delle maggiori distanze di lavoro richieste rispetto ai metodi più tradizionali (criosezioni sottili o sezioni fluttuanti). Per questo motivo, raccomandiamo la pulizia del cervello per analizzare i risultati del tracciamento del lignaggio su larga scala in più aree del cervello, invece di tentare di caratterizzare o analizzare le singole cellule.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University. 1. Creazione di un lignaggio che traccia la linea di topi Tet-On, strategie di allevamento e genotipizzazione per topi di coorte sperimentali NOTA: Qui, delineiamo la creazione di un sistema di topi Tet-On con Rosa-mTmG come gene reporter fluorescente che subisce la ricombinazione Cre, tuttavia varie altre linee repor…

Representative Results

Mentre il segnale fluorescente risultante da un sistema Tet-On con un reporter fluorescente varierà a seconda del promotore di interesse e dei fluorofori utilizzati, descriveremo come i risultati sono stati analizzati con gli animali mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. L’analisi del cervello adulto dopo un inseguimento del polso ha portato a cellule che esprimono GFP di membrana in varie nicchie anatomiche. La differenza di intensità fluorescente tra i vari tipi di cellule deve essere notata. Una variabile per quanto rigu…

Discussion

Viene descritto un metodo per la creazione, l’utilizzo e l’analisi di un triplo lignaggio transgenico che traccia la linea di topo che segna le cellule staminali all’interno del cervello di topo adulto in vivo. Se combinato con l’immunocolorazione o la pulizia del cervello, l’identificazione e la caratterizzazione delle cellule fluorescenti tracciate attraverso il cervello possono essere realizzate. Questa tecnica offre la capacità di comprendere il potenziale plastico / rigenerativo / rimodellante delle cellul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Diana Carlone (Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) e il dottor Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) per la guida utilizzando animali mTert-rtTA.

Materials

Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

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Cite This Article
Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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