تتبع نسب الخلايا الجذعية المستحثة ذات العلامات الفلورية في دماغ الفأر البالغ

قيمة خط الماوس لتتبع النسب
قد يكون تحليل الخلايا الجذعية في الجسم الحي صعبا لأن العديد من الفحوصات التي تفحص هذه الخلايا تركز فقط على توصيف هذه الخلايا في وقت وفاة الحيوان ، والذي يمثل لقطة نهائية في الوقت المناسب. لفهم أفضل لعمليات انتشار وتمايز وهجرة السلف ، وأنواع الخلايا الوسيطة / الانتقالية ، والخلايا الناضجة بمرور الوقت ، هناك حاجة إلى نهج تحليل طولي. يمكن تحقيق ذلك من خلال دراسات تتبع النسب حيث يتم تمييز الخلايا الجذعية / السلفية بشكل لا يمحى ويمكن متابعتها لأي فترة زمنية بعد¹.

في دماغ الثدييات البالغة ، تم تحليل عملية تكوين الخلايا العصبية التي يتم من خلالها إنشاء الخلايا العصبية المولودة في البالغين من الخلايا الجذعية والسلفية لأول مرة عن طريق الاحتفاظ بالتسمية باستخدام thymidine-H 3 ^2,3,4 أو 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)5,6,7,8 . في هذه الدراسات ، تم تمييز الخلايا التكاثرية بنظير الثيمين ، الذي تم دمجه في الحمض النووي للخلايا أثناء النسخ المتماثل وانقسام / انتشار الخلايا. وبالتالي فإن الخلية المعلمة ، وكذلك ذريتها ، تحتوي على هذا التناظرية ، والتي تم تحديدها بعد ذلك بعد الوفاة. ومع ذلك ، في حين أن thymidine-H³ و BrdU سمحوا بوضع علامات على الخلايا التكاثرية وذريتها في مناطق الدماغ حيث كانت الخلايا الجذعية غير مفهومة بشكل جيد ، فقد أعاقت هذه الدراسات الجوانب السلبية لهذه الأدوات. يحفز Thymidine-H³ على إيقاف دورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج ، وتثبيط تخليق الحمض النووي المعتمد على الجرعة⁹ ، في حين أن BrdU يميز الخلايا بمستويات مختلفة اعتمادا على مسار الإدارة¹⁰ ويتم تناوله من قبل الخلايا أثناء الإصلاح أو موت الخلايا المبرمج ، وكذلك أثناء انقسام الخلايا¹¹. تم استخدام طرق وضع العلامات الأكثر كفاءة مؤخرا ، مثل وضع العلامات باستخدام 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، ولكن العديد من المشكلات نفسها مثل BrdU لا تزال¹². هذه الأساليب محدودة أيضا من حيث أنها تميز أي خلية تكاثرية ، وليس فقط الخلايا الجذعية ، وبالتالي يمكن الخلط بين تفسير النتائج. في السلالة العصبية ، تحتفظ جميع الخلايا الجذعية والسلفية بالقدرة الانقسامية ، والخلايا العصبية الطرفية / الناضجة فقط ليست تكاثرية. بالنسبة للخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة ، ولكن ليس الخلايا قليلة التغصن ، يتم الحفاظ على الانتشار إلى أجل غير مسمى¹³،^14،15.

الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة في النسب تتبع فقط الخلايا التي تعبر عن بروتين مثير للاهتمام ، مثل تلك التي تم تأكيدها لتحديد الخلايا الجذعية البالغة كما نستخدمها هنا ، أصبحت أكثر شيوعا عند التحقيق في الخلايا الجذعية وذريتها. في حين أنه من الصعب توليد من خلال النهج المعدلة وراثيا للفئران ، فإن خطوط الفئران التي تتعقب النسب تسمح بتتبع الخلايا المميزة بشكل خاص في الدماغ ، ولا تعتمد على الانتشار وحده. في نظام الفأر المعدل وراثيا Tet-On ، فإن إعطاء التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين (مشتق من التتراسيكلين) يحفز تعبير Cre-recombinase في الخلايا التي تم هندستها باستخدام منشط التتراسيكلين العكسي (rtTA) ، والذي يتم نسخه من قبل مروج للاهتمام. ثم تقوم عملية إعادة التركيب التي يحركها كري المستحثة بتيت بتنشيط التعبير عن بروتين فلورسنت أو مضيئة لا يمحى في الخلايا ذات الأهمية ، اعتمادا على فأر روزا ريبورتر المستخدم. تستمر هذه الخلايا التي تحمل علامات لا تمحى في التعبير عن هذا المراسل بعد الانقسام أو التمايز أو الهجرة ، مما يسمح بتتبع هذه الخلايا وذريتها بمرور الوقت أو بعد تدخلات مختلفة¹⁶. تشمل مزايا نهج تتبع السلالات المعدلة وراثيا ما يلي: 1) خصوصية التتبع إلى سلالة خلية معينة أو سلف / خلية جذعية تتميز ب rtTA ، 2) تعبير لا يمحى عن البروتين الفلوري أو المضيء على الرغم من دوران الخلية أو التمايز ، 3) سمية منخفضة ، 4) تنشيط مشروط خلال أي نقطة في دورة حياة الحيوان ، و 5) سهولة الاستخدام مع الفحوصات الشائعة ، بما في ذلك تلطيخ المناعة / التألق المناعي¹⁶.

تشمل الطرق الأخرى لأدوات المراسل المستحثة زمنيا في الفئران استخدام فئران Cre-ERT2 ، والتي يمكن إقرانها ب ROSA-GFP ، ROSA-mTmG ، أو غيرها من الجينات المحورة لمراسل الفلورسنت. في هذه الحيوانات ، يدفع عنصر تنظيمي خاص بالخلية ، مثل منطقة مروج أو محسن ذات أهمية ، إنتاج Cre recombinase ، والذي لا يمكن تنشيطه إلا من خلال إعطاء تاموكسيفين. في حين أن خطوط الفأر Cre-ERT2 تسمح بتحريض Cre في خطوط خلية محددة ، هناك ثروة من المعرفة التي تفصل آثار تاموكسيفين على تكوين الخلايا العصبية للبالغين^17,18. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من جينات مراسل الفلورسنت التي تحركها ROSA والتي يمكن استخدامها بدلا من GFP أو mTmG ، بما في ذلك YFP أو CFP ، والتي من شأنها أن تسمح بوضع علامات الفلورسنت البديلة في الأطوال الموجية الفلورية الأخرى. يمكن استخدام جينات مراسل الفلورسنت هذه مع أنظمة Tet-On أو Cre-ERT2.

النسخ العكسي للتيلوميراز (TERT) هو المكون المحدد للمعدل في تيلوميراز الهولوإنزيم ، والذي يعمل على تمديد التيلوميرات بعد تقصيرها أثناء انقسام الخلايا^19,20. تم تحديد TERT كعلامة على الخلايا الجذعية للأنسجة البالغة في الأمعاء 21,22 ، نخاع العظم 21 ، الكبد 23 ، الدهني 24 ، بطانة الرحم^25,26 ، والعظام¹. ما إذا كان التعبير عن TERT في هذه الخلايا الجذعية البالغة هو فقط لنشاط تمديد التيلوميراز أو لأداء أدوار TERT غير الأساسية²⁷ لا يزال غير معروف. تم تحديد الخلايا الجذعية البالغة الهادئة المعبرة عن TERT (qASCs) وتتبعها في جميع أنحاء الجسم مع تتبع النسب المعدلة وراثيا لدراسة القدرة المتعددة القدرات والتجديد الذاتي لهذه الخلايا الجذعية ، بالإضافة إلى قدرتها على التنشيط والتكاثر والتمايز والهجرة¹،22^،23،28. تم إجراء إنشاء الجين المحوري Tert-rtTA سابقا¹. في هذه الورقة ، سوف نصف استخدام خط فأر TERT لتتبع النسب لدراسة TERT + qASCs التي حددناها على أنها مجموعة ASC جديدة في دماغ الفأر البالغ.

توليد خط ماوس تتبع النسب المعدلة وراثيا
لإنشاء خط فأر لتتبع النسب باستخدام نظام Tet-On ، يجب دمج ثلاثة جينات معدلة داخل واحد من خلال تزاوج الفئران. الأول هو rtTA ، الذي يتم التعبير عنه تحت سيطرة المروج للجين محل الاهتمام (لدينا هو TERT-rtTA). في الخلية التي تعبر عن هذا الجين المثير للاهتمام ، سيتم التعبير عن rtTA. والثاني هو جين oTet-Cre ، الذي يحتوي على عنصر استجابة التتراسيكلين (TRE) الذي سيسمح بنسخ Cre recombinase في وجود كل من نسخة اندماج rtTA والتتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين. يمكن إعطاء التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين للحيوان عن طريق مياه الشرب أو تشاو²⁹. أخيرا ، يجب أن يكون هناك جين سيتم تنشيطه بواسطة انقسام Cre recombinase. في هذه المخطوطة ، فإن جين وضع العلامات الذي سنصفه هو جين Rosa26-mTmG ، والذي حتى إعادة تركيب Cre سوف ينسخ mTomato في كل مكان (التألق الأحمر الغشائي في جميع الخلايا). ومع ذلك ، إذا كانت الخلية تعبر عن نسخة rtTA وتحتوي على التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين ، فإن إعادة تركيب Cre لمجموعة من مواقع lox P بين مواقع mTomato و mGFP ستغير موقع R26 وتتسبب في إنتاج الخلية غشاء EGFP (mGFP ، أو التألق الأخضر الغشائي) بدلا من الطماطم الغشائية. ستسمح الطبيعة التي لا تمحى لإشارة mGFP هذه بوضع العلامات على الخلايا وتتبعها في الجسم الحي أثناء تكاثرها وترحيلها وتمييزها. بعد التتبع ، يمكن تحليل الخلايا للتعبير عن GFP عن طريق التألق المناعي في أقسام التبريد القياسية أو الأدمغة الأكثر سمكا بصريا.

في هذه الورقة ، سنصف استخدام خط الماوس المحدد ، mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. لإنشاء خط الفأر الثلاثي المعدل وراثيا هذا ، قمنا أولا بتزاوج oTet-Cre (سلالة Jackson Lab # 006234) مع Rosa-mTmG (سلالة Jackson Lab # 007676) لإنشاء فئران ثنائية المعدلة وراثيا oTet-Cre::Rosa-mTmG. تم تشكيل هذه الحيوانات وراثيا باستخدام قوالب التمهيدي وتفاعل البوليميراز المتسلسل المشار إليها في الجدولين التكميليين 1 و 2. تم تزاوج الفئران mTert-rtTA (التي أنشأها ديفيد برولت 1) مع oTet-Cre::Rosa-mTmG لإنشاء mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG الفئران (الشكل 1A)^1,30. آلية عمل خط الماوس mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG موضحة في الشكل 1B.

تحريض الدوكسيسيكلين وتصميم مطاردة النبض
عند التخطيط للتجارب ، من المهم مراعاة العديد من العوامل التي ستؤثر على نتائج تجارب تتبع النسب ، بما في ذلك عمر الحيوان عند تحريض الدوكسيسيكلين ، وطول فترة إعطاء الدوكسيسيكلين (فترة “النبض”) ، وطول الفترة الزمنية بعد إزالة الدوكسيسيكلين قبل جمع الأنسجة (فترة “المطاردة”) ، وتوقيت أي تدخلات خلال هذه العمليات. تعتبر اعتبارات تصميم الدراسة هذه ضرورية لفهم الخلايا المصنفة وذريتها في ختام التجربة. الخطوة الأولى في هذه العملية هي تحديد عمر اهتمام الحيوان وطول إدارة الدوكسيسيكلين. ستسمح فترات النبض الأطول بإمكانية التعبير عن المزيد من الخلايا للتعبير عن المروج المرتبط ب rtTA ووضع علامة على المزيد من الخلايا المثيرة للاهتمام بشكل لا يمحى. قد يتطلب نوع الخلايا الذي يظهر تعبيرا عابرا عن الجين محل الاهتمام فترة نبض أطول من الخلايا التي تعبر باستمرار عن الجين محل الاهتمام. ومع ذلك ، إذا كان الهدف من الدراسة هو فهم الآثار قصيرة الأجل للخلية ذات الاهتمام أو التدخل الحاد ، فإن فترة النبض لا يمكن أن تكون طويلة جدا ، لأنه بمجرد وضع علامة على الخلية ، سيتم تتبعها من خلال أي عدد من التغييرات خلال الفترة المتبقية من فترة النبض. في بعض دراساتنا ، تم استخدام نبض 2 يوم بدون فترة مطاردة لتقليد مراسل مباشر ل TERT عن كثب. وذلك لأن الحد الأدنى من الوقت لإعادة تركيب الجين Rosa-mTmG هو 2 أيام³¹.

الفترة الأساسية التالية في تجربة مطاردة النبض هي الطول بين إزالة الدوكسيسيكلين وتروية الحيوان ، المعروف أيضا باسم “المطاردة”. يبلغ عمر النصف للدوكسيسيكلين في الفئران حوالي 170 دقيقة بغض النظر عن مسار الإدارة ، مما يسمح باستنتاج مفاده أن تحريض الدوكسيسيكلين لم يعد يحدث على الأرجح بعد عدة ساعات من الإزالة³². ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن استقلاب الدوكسيسيكلين أبطأ في الفئران المسنة ، مما قد يؤدي إلى فترات “نبض” فعالة أطول من الحيوانات الصغيرة³³.

خلال فترة المطاردة ، سيستمر تصنيف الخلايا المصنفة ، حتى بعد الانتشار أو التمايز أو الهجرة. سيتم أيضا تسمية ذرية هذه الخلايا. الهدف من الدراسة سيشكل طول نموذج مطاردة النبض. إذا كان الهدف من الدراسة هو فهم تجديد الأنسجة على مدى فترة طويلة من الزمن مع الخلايا ذات الاهتمام ، فقد تكون هناك حاجة إلى فترة مطاردة طويلة. وأخيرا، يجب تحديد توقيت أي تدخلات أو علاجات. ستؤثر الإدارة خلال فترة النبض على الخلايا التي تعبر عن الجين محل الاهتمام وكذلك أي ذرية تم إنشاؤها خلال هذا الوقت ، في حين أن الإدارة خلال فترة المطاردة قد تؤثر في الغالب على ذرية الخلايا ذات الاهتمام ، على الرغم من أن هذا سيعتمد على مدى سرعة انقسام الخلايا المصنفة أو تمايزها. ويرد في الشكل 2 ألف أمثلة على التصاميم التجريبية لمطاردة النبض التي استخدمناها.

من المهم أيضا أن تكون على دراية بإمكانية إشارة GFP الخلفية بسبب التعبير المتسرب. يحدث التعبير المتسرب نتيجة لإمكانات الارتباط المتأصلة بين RTTA وتسلسلات Otet في غياب الدوكسيسيكلين ، والنشاط المتبقي للجين الوراثي Otet في غياب rtTA (تمت مراجعته في³⁴). يمثل التعبير المتسرب نقطة ضعف واحدة في أنظمة Tet ، وعلى الرغم من أن التسرب غالبا ما يكون جانبا سلبيا مقبولا للنظام ، إلا أن الحالات التي يمكن أن يؤدي فيها التعبير المتسرب إلى السمية والوفيات ، مثل توكسين diptheria (DTA) في Otet-DTA يمكن أن تحد من استخدام هذه الأنظمة³⁵.

معالجة الدماغ والتقسيم والتألق المناعي للأقسام الرقيقة للفحص المجهري
لتحليل أدمغة الفئران بعد تجربة تتبع النسب ، يجب أولا اختراق الفئران عن طريق التروية عبر القلب لإزالة الدم والسائل الدماغي الشوكي الذي يمكن أن يؤدي إلى تألق ذاتي عال في الدماغ. هناك نوعان من المثبتات شائعة الاستخدام التي يمكن للحيوان أن يتخلل معها: Histochoice Tissue Fixative، وهو مثبت جليوكسال (GF)، أو 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). تسمح مثبتات Glyoxal بعملية تثبيت لطيفة نسبيا مع ربط متقاطع أقل من PFA. هذا يقلل من تصلب الأنسجة ، ويقلل من الحاجة إلى استرجاع المستضدات ، ويسمح بحلول الأجسام المضادة الأقل تركيزا أثناء تلطيخ المناعة. ومع ذلك ، إذا كانت تحتوي على الميثانول ، فقد يعمل ذلك على زيادة التألق الذاتي³⁶. من ناحية أخرى ، غالبا ما يسمح PFA بتثبيت أكثر قوة ، وبينما ستكون هناك حاجة إلى استرجاع المستضد أثناء التلطيخ المناعي ، هناك أجسام مضادة ستعمل فقط مع الأنسجة الثابتة PFA ، والتروية مع PFA 4٪ مطلوبة لتقنية التطهير البصري الموضحة لاحقا.

بعد التروية هو خطوة ما بعد التثبيت ، حيث يتم غمر الأدمغة في نفس النوع من المثبت المستخدم أثناء التروية بين عشية وضحاها. هذا يسمح لأي مناطق في الدماغ ربما لم يتم إصلاحها بالكامل أثناء التروية بالاستمرار في الإصلاح. بعد ذلك ، سيتم احتضان الأدمغة في السكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء قبل خطوة التجميد لمنع تكوين الجليد داخل الأنسجة (“الحفظ بالتبريد”). يمكن بعد ذلك قطع الأدمغة إلى أي عدد من أقسام الأنسجة السهمية أو الإكليلية أو المستعرضة للمعالجة. من أجل كل من الدقة والتكرار ، يجب استخدام كتل الدماغ المعايرة بطريقة تضمن قطعا متسقة بين الحيوانات. العامل الأكثر أهمية الذي يمكن أن يؤثر على كيفية تقسيم الأدمغة هو منطقة (مناطق) الدماغ ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، في حين أن القطع السهمي قد يسمح بتحليل المزيد من مناطق الدماغ في قسم واحد من الأنسجة ، فإن هذا القطع لن يسمح بتحليل المناطق العصبية / الدبقية في المنطقة البطينية تحت البطينية (V-SVZ) لأن الجانبين الجانبي والإنسي للبطين الجانبي سيكون من المستحيل تمييزهما في هذا البعد ويتم ملاحظتهما بشكل أفضل في المستوى الإكليلي. يمكن أن يكون هذا تمييزا مهما في دراسات تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، حيث يحتوي الجانب الجانبي من البطين الجانبي على V-SVZ العصبي المنشأ ، في حين أن الجدار الإنسي للبطين الجانبي هو مكانة أكثر دبقية³⁷.

بعد تقسيم الأنسجة إلى أقسام إكليلية أو سهمية أو عرضية ، سيتم تجميدها إلى كتل باستخدام محلول تضمين درجة حرارة التبريد المثلى (OCT). هنا ، يتم تجميد الأدمغة داخل هذه المادة المضمنة ، باستخدام مزيج من الثلج الجاف والإيثانول. إذا كان تحليل المقطع الرفيع مطلوبا ، تقطيع الكتل إلى شرائح على جهاز تبريد ، واعتمادا على التحليل النهائي المطلوب ، يمكن الالتزام بالشرائح الزجاجية المشحونة إيجابيا كمقاطع رقيقة (<20 ميكرومتر). يمكن أيضا استخدام الشرائح الزجاجية غير المشحونة ، ولكن قد يؤدي استخدام الشرائح غير المشحونة إلى فك الأنسجة من الشرائح³⁸. إذا كانت هناك حاجة إلى أقسام الأنسجة العائمة الحرة متوسطة السماكة (>20 ميكرومتر) ، جمع الأنسجة كأقسام عائمة بحرية. إذا كانت هناك حاجة إلى مقاطع سميكة (0.5-4 مم) ، فيجب تقطيع أقسام الدماغ غير المجمدة باستخدام اهتزاز. من المهم ملاحظة اختلافات التخزين بين الأقسام الموجودة على الشرائح ، والتي تتطلب التجميد عند -20 إلى -80 درجة مئوية والأقسام العائمة بحرية ، والتي سيتم تخزينها عند 4 درجات مئوية.

تطهير الدماغ وكامل جبل المجهر البؤري المناعي
إذا كانت هناك حاجة إلى تحليل أوسع نطاقا ، ولكن أقل تفصيلا للخلايا التي تتبع النسب في دماغ الفأر ، فمن الممكن إجراء تحليل شامل للأجزاء الأكثر سمكا من أنسجة المخ باستخدام iDISCO لمسح الدماغ³⁹ متبوعا بالمناعة والمجهر البؤري z-stack المبلط أو المجهر ذي الورقة الضوئية. هنا ، سيتم مسح أجزاء كبيرة من دماغ الفأر بصريا (عملية إزالة الدهون³⁹) ، مما يسمح بشكل أفضل بتصوير إشارة الفلورسنت عبر قسم أنسجة 1 مم. الجوانب السلبية لهذه العملية هي التألق الذاتي العالي وتضاؤل القدرة على الحصول على صور عالية الدقة لمورفولوجيا الخلايا وتحليل مفصل للتلطيخ المشترك بسبب زيادة مسافات العمل المطلوبة عند مقارنتها بالطرق التقليدية (أقسام التبريد الرقيقة أو الأقسام العائمة بحرية). لهذا السبب، نوصي بتطهير الدماغ لتحليل نتائج تتبع النسب على نطاق واسع في جميع أنحاء مناطق الدماغ المتعددة، بدلا من محاولة توصيف أو تحليل الخلايا الفردية.