マウスモデルを用いた家族性肥大型心筋症におけるMYH7変異Gly823Gluの病態解明
Summary
我々の臨床研究で発見された家族性遺伝性心筋症ファミリーに基づいて、CRISPR/Cas9を介したゲノム工学により、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作成し、この変異を検証しました。
Abstract
家族性肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は、中国で最も一般的な心筋症です。しかし、HCMの根底にある遺伝的病因はとらえどころのないままです。
我々は以前、HCMを有する中国の大規模な漢族において、ミオシン重鎖7(MYH7)遺伝子ヘテロ接合型変異体NM_000257.4:c.G2468A(p.G823E)を同定した。このファミリーでは、バリアントG823Eは常染色体優性障害と共離します。この変異体は、MYH7タンパク質の頸部領域のレバーアームドメインに位置し、相同ミオシンおよび種の間で高度に保存されています。G823E変異体の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作製しました。gRNAターゲティングベクターとドナーオリゴヌクレオチド(ターゲティング配列に134 bpの相同性)を設計しました。ドナーオリゴヌクレオチド中のp.G823E(GGGからGAG)部位を、相同性指向修復によってMYH7のエクソン23に導入した。サイレンシングされたp.R819(AGGからCGAへ)も挿入され、相同性指向修復後の配列のgRNA結合および再切断を防止した。心エコー検査で生後2カ月齢のMYH7 G823E/-マウスに収縮期を伴う左室後壁(LVPW)肥大を認めた.これらの結果は、同様に組織学的分析によって検証されました(図3)。
これらの結果は、G823E変異体がHCMの病因において重要な役割を果たすことを示しています。今回の知見は、家族性HCMに関連するMYH7変異体のスペクトルを豊かにし、この中国人科における遺伝カウンセリングと出生前診断の指針となる可能性がある。
Introduction
肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は中国で最も一般的な心筋症であり、推定発生率は0.2%で、15万人が罹患しています1,2。
HCMを特徴付ける病理学的解剖学的特徴は非対称心室肥大であり、これはしばしば心室流出路および/または心室中隔を含む3。臨床症状は、労作性呼吸困難、疲労、および胸痛です。HCMの個々の表現型は、臨床的に潜行性から重度の心不全までの範囲の変動性を有する。HCMの患者は、治療、心臓移植、生命維持装置、および学際的なフォローアップを必要とします4。
前世紀、PCR技術はDNA5の研究方法を変えました。臨床診断のためのDNAシーケンシング法がSangerらによって発見された6。サンガー法はその後、ヒトゲノムプロジェクトに適用されましたが、このアプローチはコストと時間がかかりました7。全ゲノムシーケンス(WGS)の出現により、ヒトの遺伝病に関する洞察が新たな高みに達しましたが、コストの点で法外なままでした。全エクソームシーケンシング(WES)技術は、生殖細胞系列の変異を検出するために長い間使用されており8 、さまざまな癌のエクソームにおける体細胞ドライバー変異の特定に成功しています9。WESによるDNAエクソンまたはコード領域の検出は、ほとんどのメンデル病における病原性多様体を明らかにするために使用することができる。今日、シーケンシングのコストが下がるにつれて、WGSはゲノミクス研究の重要なツールになると期待されており、ゲノム中の病原性多様体の検出に広く使用することができます。
WES技術は、病因をさらに解明するために病原性多様体を特定するために、遺伝性心筋症でも使用されています。新たな証拠は、MYH7 10、MYH6 11、MYBPC3 12、MYL2 13、MYL3 14、TNNT215、TNNI3 16、TNNC1 17、およびTPM1 18などのサルコメア構造タンパク質遺伝子変異をコードする遺伝子がHCMの遺伝的病因の原因であることを示唆している。希少疾患の原因となる遺伝子(例えば、オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびチチン相互作用のRhoGEF(OBSCN、OMIM:608616)19、作用アルファ2(ACTN2、OMIM:102573)20、およびシステインおよびグリシンリッチタンパク質3(CSRP3、OMIM:600824)21)における病原性多様体の認識もHCMと関連しています。現在の遺伝学的研究では、HCM患者の約40%〜60%でサルコメアタンパク質遺伝子に複数の異なる病原性多様体が同定されており、HCM患者の遺伝子検査により、ほとんどの病原性多様体はミオシン重鎖(MYH7)およびミオシン結合タンパク質C(MYBPC3)で発生することが明らかになりました。しかし、HCMの遺伝的根拠はとらえどころのないままです。ヒトHCM患者の根底にあるこれらの変動の病原性を調査することは、依然として大きな課題です22。
本研究では、WESによるHCMを有する中国の漢族におけるMYH7の病原性多様体を報告する。この変異株の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9システムを使用してC57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスを樹立しました。また、このバリアントのもっともらしいメカニズムについても説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では,HCMを有する中国漢族の家族について述べる。遺伝学解析により、ヘテロ接合型のMYH6変異p.G823Eは、常染色体優性遺伝の家族において疾患と共分離することが明らかになりました。G823E変異の病原性を検証し、そのメカニズムを議論するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMyh7遺伝子座にG823Eを備えたC57BL/6Nマウスモデルを作成しました。
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、広東省の医学研究基金プロジェクト(A2022363)および中国広東省科学技術委員会の主要プロジェクト(助成金番号2022)によってサポートされました。
この原稿の準備に協力してくれたメリーランド大学カレッジパーク校のQingjian Chenに感謝します。
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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