Studio della patogenesi della mutazione MYH7 Gly823Glu nella cardiomiopatia ipertrofica familiare utilizzando un modello murino
Summary
Sulla base della famiglia di cardiomiopatie ereditarie familiari trovata nel nostro lavoro clinico, abbiamo creato un modello murino C57BL / 6N con una mutazione puntiforme (G823E) nel locus MYH7 del topo attraverso l’ingegneria del genoma mediata da CRISPR / Cas9 per verificare questa mutazione.
Abstract
La cardiomiopatia ipertrofica familiare (HCM, OMIM: 613690) è la cardiomiopatia più comune in Cina. Tuttavia, l’eziologia genetica sottostante della CMI rimane elusiva.
Abbiamo precedentemente identificato una variante eterozigote del gene della miosina a catena pesante 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), in una grande famiglia Han cinese con HCM. In questa famiglia, la variante G823E cosegrega con una malattia autosomica dominante. Questa variante si trova nel dominio del braccio di leva della regione del collo della proteina MYH7 ed è altamente conservata tra le miosine e le specie omologhe. Per verificare la patogenicità della variante G823E, abbiamo prodotto un modello murino C57BL/6N con una mutazione puntiforme (G823E) nel locus del topo MYH7 con ingegneria genomica mediata da CRISPR / Cas9. Abbiamo progettato vettori bersaglio del gRNA e oligonucleotidi del donatore (con sequenze di targeting affiancate da 134 bp di omologia). Il sito p.G823E (da GGG a GAG) nell’oligonucleotide donatore è stato introdotto nell’esone 23 di MYH7 mediante riparazione diretta dall’omologia. È stato anche inserito un p.R819 silenziato (da AGG a CGA) per prevenire il legame del gRNA e la ri-scissione della sequenza dopo la riparazione diretta dall’omologia. L’ecocardiografia ha rivelato ipertrofia della parete posteriore ventricolare sinistra (LVPW) con sistole nei topi MYH7 G823E/- a 2 mesi di età. Anche questi risultati sono stati convalidati dall’analisi istologica (Figura 3).
Questi risultati dimostrano che la variante G823E svolge un ruolo importante nella patogenesi dell’HCM. I nostri risultati arricchiscono lo spettro delle varianti di MYH7 legate alla CMI familiare e possono fornire una guida per la consulenza genetica e la diagnosi prenatale in questa famiglia cinese.
Introduction
La cardiomiopatia ipertrofica (HCM, OMIM: 613690) è la cardiomiopatia più comune in Cina, con un’incidenza stimata dello 0,2%, che colpisce 150.000 persone 1,2.
La caratteristica anatomica patologica che caratterizza la CMI è l’ipertrofia ventricolare asimmetrica, che spesso coinvolge il tratto di efflusso ventricolare e/o il setto interventricolare3. La manifestazione clinica è dispnea da sforzo, affaticamento e dolore toracico. Il fenotipo individuale della CMI ha una variabilità che varia da clinicamente insidiosa a grave insufficienza cardiaca. I pazienti con CMI richiedono cure mediche, trapianto di cuore, attrezzature di supporto vitale e follow-up multidisciplinare4.
Nel secolo scorso, la tecnologia PCR ha cambiato il modo in cui studiamo il DNA5. Un metodo di sequenziamento del DNA per la diagnosi clinica è stato scoperto da Sanger e colleghi6. La tecnica Sanger è stata successivamente applicata al Progetto Genoma Umano, ma questo approccio è stato costoso e dispendioso in termini di tempo7. L’avvento del sequenziamento dell’intero genoma (WGS) ha portato le conoscenze sulle malattie genetiche umane a nuovi livelli, ma è rimasto proibitivo in termini di costi. La tecnologia di sequenziamento dell’intero esoma (WES) è stata a lungo utilizzata per rilevare le varianti germinali8 e ha avuto successo nell’identificare le mutazioni somatiche del driver nell’esoma di vari tumori9. La rilevazione di esoni di DNA o regioni codificanti mediante WES può essere utilizzata per rivelare varianti patogene nella maggior parte delle malattie mendeliane. Oggi, con la diminuzione del costo del sequenziamento, WGS dovrebbe diventare uno strumento importante nella ricerca genomica e può essere ampiamente utilizzato nella rilevazione di varianti patogene nel genoma.
La tecnologia WES è stata utilizzata anche nella cardiomiopatia ereditaria per identificare varianti patogene per chiarire ulteriormente l’eziologia. Prove emergenti hanno implicato che i geni che codificano le mutazioni genetiche della proteina strutturale del sarcomero, come MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 eTPM1 18 sono responsabili dell’eziologia genetica dell’HCM. La consapevolezza di varianti patogene in geni che causano malattie rare (ad esempio, oscurantina, calmodulina citoscheletrica e RhoGEF INTERAGENTE CON TITINA (OBSCN, OMIM: 608616)19, alfa 2 che agisce (ACTN2, OMIM: 102573)20 e proteina ricca di cisteina e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) è stata anche associata all’HCM. Gli attuali studi genetici hanno identificato più varianti patogene distinte nel gene della proteina sarcomerica in circa il 40% -60% dei pazienti con HCM, e test genetici in pazienti con HCM hanno rivelato che la maggior parte delle varianti patogene si verificano nella catena pesante della miosina (MYH7) e nella proteina C legante la miosina (MYBPC3). Tuttavia, la base genetica per HCM rimane elusiva. Esplorare la patogenicità di queste variazioni che sono alla base dei pazienti umani con HCM rimane una grande sfida22.
In questo studio, riportiamo una variante patogena in MYH7 in una famiglia Han cinese con HCM di WES. Al fine di verificare la patogenicità di questa variante, abbiamo stabilito un topo knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) utilizzando il sistema CRISPR / Cas9. Discutiamo anche i meccanismi plausibili di questa variante.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, descriviamo una famiglia Han cinese con HCM. L’analisi genetica ha rivelato che una mutazione eterozigote di MYH6 p.G823E co-segrega con la malattia nei membri della famiglia con trasmissione autosomica dominante. Per convalidare la patogenicità della mutazione G823E e discutere i meccanismi sottostanti, abbiamo creato un modello murino C57BL/6N con G823E nel locus Myh7 del topo mediante ingegneria genomica mediata da CRISPR / Cas9.
Le caratteristiche fenotipiche dei topi kn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Medical Research Fund della provincia del Guangdong (A2022363) e dal grande progetto del Guangdong Committee of Science and Technology, Cina (sovvenzione n. 2022).
Vorremmo ringraziare Qingjian Chen dell’Università del Maryland, College Park per l’aiuto durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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