Investigación de la patogénesis de la mutación MYH7 Gly823Glu en la miocardiopatía hipertrófica familiar utilizando un modelo de ratón
Summary
Basándonos en la familia de miocardiopatía hereditaria familiar encontrada en nuestro trabajo clínico, creamos un modelo de ratón C57BL / 6N con una mutación puntual (G823E) en el locus MYH7 del ratón a través de la ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar esta mutación.
Abstract
La miocardiopatía hipertrófica familiar (HCM, OMIM: 613690) es la miocardiopatía más común en China. Sin embargo, la etiología genética subyacente de la MCH sigue siendo difícil de alcanzar.
Previamente identificamos una variante heterocigota del gen de la cadena pesada de miosina 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), en una gran familia china Han con MCH. En esta familia, la variante G823E cosegrega con un trastorno autosómico dominante. Esta variante se localiza en el dominio del brazo de palanca de la región del cuello de la proteína MYH7 y está altamente conservada entre las miosinas y especies homólogas. Para verificar la patogenicidad de la variante G823E, producimos un modelo de ratón C57BL / 6N con una mutación puntual (G823E) en el locus MYH7 del ratón con ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9. Diseñamos vectores dirigidos a ARNg y oligonucleótidos donantes (con secuencias dirigidas flanqueadas por 134 pb de homología). El sitio p.G823E (GGG a GAG) en el oligonucleótido del donante se introdujo en el exón 23 de MYH7 mediante reparación dirigida por homología. También se insertó un p.R819 silenciado (AGG a CGA) para evitar la unión del ARNg y la re-escisión de la secuencia después de la reparación dirigida por homología. La ecocardiografía reveló hipertrofia de la pared posterior del ventrículo izquierdo (BPN) con sístole en ratones MYH7 G823E/- a los 2 meses de edad. Estos resultados también fueron validados por análisis histológico (Figura 3).
Estos resultados demuestran que la variante G823E juega un papel importante en la patogénesis de la MCH. Nuestros hallazgos enriquecen el espectro de variantes de MYH7 relacionadas con la MCH familiar y pueden proporcionar orientación para el asesoramiento genético y el diagnóstico prenatal en esta familia china.
Introduction
La miocardiopatía hipertrófica (HCM, OMIM: 613690) es la miocardiopatía más frecuente en China, con una incidencia estimada del 0,2%, afectando a 150.000 personas 1,2.
La característica anatómica patológica que caracteriza a la MCH es la hipertrofia ventricular asimétrica, que a menudo involucra el tracto de salida ventricular y/o el tabique interventricular3. La manifestación clínica es disnea de esfuerzo, fatiga y dolor torácico. El fenotipo individual de HCM tiene una variabilidad que va desde clínicamente insidiosa hasta insuficiencia cardíaca grave. Los pacientes con MCH requieren tratamiento médico, trasplante cardíaco, equipo de soporte vital y seguimiento multidisciplinario4.
En el siglo pasado, la tecnología de PCR ha cambiado la forma en que estudiamos el ADN5. Un método de secuenciación de ADN para el diagnóstico clínico fue descubierto por Sanger y colegas6. La técnica de Sanger se aplicó posteriormente al Proyecto Genoma Humano, pero este enfoque era costoso y consumía mucho tiempo7. El advenimiento de la secuenciación del genoma completo (WGS) llevó los conocimientos sobre la enfermedad genética humana a nuevas alturas, pero siguió siendo prohibitivo en términos de costo. La tecnología de secuenciación del exoma completo (WES) se ha utilizado durante mucho tiempo para detectar variantes de la línea germinal8 y ha tenido éxito en la identificación de mutaciones conductoras somáticas en el exoma de varios cánceres9. La detección de exones de ADN o regiones codificantes por WES se puede utilizar para revelar variantes patogénicas en la mayoría de las enfermedades mendelianas. Hoy en día, con la disminución del costo de la secuenciación, se espera que WGS se convierta en una herramienta importante en la investigación genómica y pueda ser ampliamente utilizada en la detección de variantes patogénicas en el genoma.
La tecnología WES también se ha utilizado en la miocardiopatía hereditaria para identificar variantes patogénicas para dilucidar aún más la etiología. La evidencia emergente ha implicado que los genes que codifican mutaciones genéticas de proteínas estructurales del sarcómero, como MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 yTPM1 18 son responsables de la etiología genética de HCM. El conocimiento de variantes patogénicas en genes causantes de enfermedades raras (por ejemplo, oscurana, calmodulina citoesquelética y RhoGEF QUE INTERACTÚAN CON LA TITINA (OBSCN, OMIM: 608616)19, alfa de acción 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, y cisteína y proteína rica en glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) también se ha asociado con HCM. Los estudios genéticos actuales han identificado múltiples variantes patogénicas distintas en el gen de la proteína sarcomérica en aproximadamente el 40% -60% de los pacientes con HCM, y las pruebas genéticas en pacientes con HCM revelaron que la mayoría de las variantes patogénicas ocurren en la cadena pesada de miosina (MYH7) y la proteína C de unión a miosina (MYBPC3). Sin embargo, la base genética de la HCM sigue siendo difícil de alcanzar. Explorar la patogenicidad de estas variaciones que subyacen a los pacientes humanos con HCM sigue siendo un desafío importante22.
En este estudio, informamos una variante patogénica en MYH7 en una familia Han china con HCM por WES. Para verificar la patogenicidad de esta variante, establecimos un ratón knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) utilizando el sistema CRISPR / Cas9. También discutimos mecanismos plausibles de esta variante.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, describimos una familia china Han con HCM. El análisis genético reveló que una mutación heterocigótica en MYH6 p.G823E co-segrega con la enfermedad en miembros de la familia con herencia autosómica dominante. Para validar la patogenicidad de la mutación G823E y discutir los mecanismos subyacentes, creamos un modelo de ratón C57BL / 6N con G823E en el locus Myh7 del ratón mediante ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9.
Las características fenotípicas de los…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el proyecto del Fondo de Investigación Médica de la provincia de Guangdong (A2022363) y el proyecto principal del Comité de Ciencia y Tecnología de Guangdong, China (subvención no.2022).
Nos gustaría agradecer a Qingjian Chen de la Universidad de Maryland, College Park por la ayuda durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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