Untersuchung der Pathogenese der MYH7-Mutation Gly823Glu bei familiärer hypertropher Kardiomyopathie anhand eines Mausmodells
Summary
Basierend auf der familiären erblichen Kardiomyopathie-Familie, die in unserer klinischen Arbeit gefunden wurde, erstellten wir ein C57BL / 6N-Mausmodell mit einer Punktmutation (G823E) am MYH7-Locus der Maus durch CRISPR / Cas9-vermitteltes Genom-Engineering, um diese Mutation zu verifizieren.
Abstract
Die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) ist die häufigste Kardiomyopathie in China. Die zugrunde liegende genetische Ätiologie von HCM bleibt jedoch schwer fassbar.
Wir haben zuvor eine Myosin-Schwerketten-7 (MYH7)-Gen-heterozygote Variante NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) in einer großen chinesischen Han-Familie mit HCM identifiziert. In dieser Familie ist die Variante G823E mit einer autosomal-dominanten Erkrankung getrennt. Diese Variante befindet sich in der Hebelarmdomäne der Halsregion des MYH7-Proteins und ist unter homologen Myosinen und Spezies hoch konserviert. Um die Pathogenität der G823E-Variante zu überprüfen, produzierten wir ein C57BL/6N-Mausmodell mit einer Punktmutation (G823E) am Maus-MYH7-Locus mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Genom-Engineering. Wir entwarfen gRNA-Targeting-Vektoren und Donor-Oligonukleotide (mit Targeting-Sequenzen, die von 134 bp Homologie flankiert werden). Die p.G823E-Stelle (GGG zu GAG) im Donor-Oligonukleotid wurde durch homologiegesteuerte Reparatur in Exon 23 von MYH7 eingebracht. Ein schallgedämpftes p.R819 (AGG zu CGA) wurde ebenfalls eingefügt, um eine gRNA-Bindung und Re-Spaltung der Sequenz nach homologiegesteuerter Reparatur zu verhindern. Die Echokardiographie ergab eine linksventrikuläre hintere Wand (LVPW) Hypertrophie mit Systole bei MYH7 G823E/- Mäusen im Alter von 2 Monaten. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls durch histologische Analysen validiert (Abbildung 3).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die G823E-Variante eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von HCM spielt. Unsere Ergebnisse bereichern das Spektrum der MYH7-Varianten, die mit familiärer HCM verbunden sind, und können eine Anleitung für die genetische Beratung und pränatale Diagnose in dieser chinesischen Familie bieten.
Introduction
Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) ist mit einer geschätzten Inzidenz von 0,2% die häufigste Kardiomyopathie in China, von der 150.000 Menschen betroffen sind 1,2.
Das pathologische anatomische Merkmal, das HCM charakterisiert, ist die asymmetrische ventrikuläre Hypertrophie, die häufig den ventrikulären Ausflusstrakt und / oder das interventrikuläre Septum3 betrifft. Die klinische Manifestation ist Belastungsdyspnoe, Müdigkeit und Brustschmerzen. Der individuelle Phänotyp der HCM weist eine Variabilität auf, die von klinisch heimtückischer bis zu schwerer Herzinsuffizienz reicht. Patienten mit HCM benötigen medizinische Behandlung, Herztransplantation, lebenserhaltende Ausrüstung und multidisziplinäre Nachsorge4.
Im vergangenen Jahrhundert hat die PCR-Technologie die Art und Weise verändert, wie wir DNA5 untersuchen. Eine DNA-Sequenzierungsmethode für die klinische Diagnose wurde von Sanger und Kollegen entdeckt6. Die Sanger-Technik wurde später auf das Human Genome Project angewendet, aber dieser Ansatz war kostspielig und zeitaufwendig7. Das Aufkommen der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) brachte Einblicke in menschliche genetische Krankheiten auf neue Höhen, blieb aber in Bezug auf die Kosten unerschwinglich. Die Whole-Exom-Sequenzierungstechnologie (WES) wird seit langem zum Nachweis von Keimbahnvarianten8 eingesetzt und war erfolgreich bei der Identifizierung somatischer Treibermutationen im Exom verschiedener Krebsarten9. Der Nachweis von DNA-Exons oder kodierenden Regionen durch WES kann verwendet werden, um pathogene Varianten bei den meisten Mendelschen Erkrankungen aufzudecken. Heute, mit den sinkenden Kosten für die Sequenzierung, wird erwartet, dass WGS zu einem wichtigen Werkzeug in der Genomforschung wird und bei der Erkennung pathogener Varianten im Genom weit verbreitet sein kann.
Die WES-Technologie wurde auch bei der erblichen Kardiomyopathie eingesetzt, um pathogene Varianten zu identifizieren, um die Ätiologie weiter aufzuklären. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Gene, die Sarkomer-Strukturprotein-Genmutationen kodieren, wie MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 undTPM1 18, für die genetische Ätiologie von HCM verantwortlich sind. Das Bewusstsein für pathogene Varianten in seltenen krankheitsverursachenden Genen (z. B. Obscurin, Zytoskelett-Calmodulin und Titin-interagierendes RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, wirkendes Alpha 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 und Cystein und glycinreiches Protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) wurde ebenfalls mit HCM in Verbindung gebracht. Aktuelle genetische Studien haben bei etwa 40% -60% der HCM-Patienten mehrere verschiedene pathogene Varianten im Sarkomerproteingen identifiziert, und Gentests bei HCM-Patienten ergaben, dass die meisten pathogenen Varianten in der Myosin-Schwerkette (MYH7) und dem Myosin-bindenden Protein C (MYBPC3) vorkommen. Die genetische Grundlage für HCM bleibt jedoch schwer fassbar. Die Erforschung der Pathogenität dieser Variationen, die den menschlichen HCM-Patienten zugrunde liegen, bleibt eine große Herausforderung22.
In dieser Studie berichten wir über eine pathogene Variante in MYH7 in einer chinesischen Han-Familie mit HCM von WES. Um die Pathogenität dieser Variante zu überprüfen, haben wir eine C57BL/6N-Myh7em1(G823E) Knockin-Maus mit dem CRISPR/Cas9-System etabliert. Wir diskutieren auch plausible Mechanismen dieser Variante.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie beschreiben wir eine chinesische Han-Familie mit HCM. Die genetische Analyse ergab, dass eine heterozygote MYH6-Mutation p.G823E bei Familienmitgliedern mit autosomal-dominanter Vererbung mit der Krankheit kosegnet. Um die Pathogenität der G823E-Mutation zu validieren und die zugrunde liegenden Mechanismen zu diskutieren, erstellten wir ein C57BL/6N-Mausmodell mit G823E am Myh7-Locus der Maus durch CRISPR/Cas9-vermitteltes Genom-Engineering.
Phänotypische Merkmale von C57BL/…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Medical Research Fund Projekt der Provinz Guangdong (A2022363) und das Großprojekt des Guangdong Committee of Science and Technology, China (Fördernummer 2022) unterstützt.
Wir danken Qingjian Chen von der University of Maryland, College Park für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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