חקירת הפתוגנזה של מוטציית MYH7 Gly823Glu בקרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית באמצעות מודל עכבר
Summary
בהתבסס על משפחת הקרדיומיופתיה התורשתית המשפחתית שנמצאה בעבודה הקלינית שלנו, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר באמצעות הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לאמת מוטציה זו.
Abstract
קרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית (HCM, OMIM: 613690) היא הקרדיומיופתיה הנפוצה ביותר בסין. עם זאת, האטיולוגיה הגנטית הבסיסית של HCM נותרה חמקמקה.
בעבר זיהינו גרסה הטרוזיגוטית של גן מיוזין כבד שרשרת 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), במשפחת האן סינית גדולה עם HCM. במשפחה זו, גרסה G823E cosegregates עם הפרעה אוטוזומלית דומיננטית. גרסה זו ממוקמת בתחום זרוע המנוף של אזור הצוואר של חלבון MYH7 ונשמרת מאוד בקרב מיוסינים ומינים הומולוגיים. כדי לאמת את הפתוגניות של גרסת G823E, ייצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר עם הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9. עיצבנו וקטורים המכוונים ל-gRNA ולאוליגונוקלאוטידים של תורמים (עם רצפי מיקוד עם 134 bp של הומולוגיה). אתר p.G823E (GGG to GAG) באוליגונוקלאוטיד התורם הוכנס לאקסון 23 של MYH7 על ידי תיקון מכוון הומולוגיה. p.R819 מושתק (AGG ל-CGA) הוכנס גם הוא כדי למנוע קשירת gRNA וביקוע מחדש של הרצף לאחר תיקון מכוון הומולוגיה. אקוקרדיוגרפיה חשפה היפרטרופיה של דופן אחורית של החדר השמאלי (LVPW) עם סיסטולה בעכברי MYH7 G823E/- בגיל חודשיים. תוצאות אלה אומתו גם על ידי ניתוח היסטולוגי (איור 3).
תוצאות אלה מראות כי וריאנט G823E ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של HCM. הממצאים שלנו מעשירים את הספקטרום של וריאנטים MYH7 הקשורים ל- HCM משפחתי ועשויים לספק הדרכה לייעוץ גנטי ואבחון טרום לידתי במשפחה סינית זו.
Introduction
קרדיומיופתיה היפרטרופית (HCM, OMIM: 613690) היא הקרדיומיופתיה הנפוצה ביותר בסין, עם שכיחות מוערכת של 0.2%, המשפיעה על 150,000 אנשים 1,2.
התכונה האנטומית הפתולוגית המאפיינת את HCM היא היפרטרופיה חדרית אסימטרית, שלעתים קרובות מערבת את מערכת היציאה של החדר ו / או מחיצה בין-חדרית3. הביטוי הקליני הוא קוצר נשימה במאמץ, עייפות וכאבים בחזה. לפנוטיפ האינדיבידואלי של HCM יש שונות הנעה בין חתרני קלינית לאי ספיקת לב חמורה. חולים עם HCM זקוקים לטיפול רפואי, השתלת לב, ציוד תומך חיים ומעקב רב-תחומי4.
במאה האחרונה, טכנולוגיית PCR שינתה את האופן שבו אנו חוקרים דנ”א5. שיטת ריצוף DNA לאבחון קליני התגלתה על ידי סנגר ועמיתיו6. טכניקת סנגר יושמה לאחר מכן בפרויקט הגנום האנושי, אך גישה זו הייתה יקרה וגוזלת זמן7. הופעתו של ריצוף גנום שלם (WGS) הביאה את התובנות על מחלות גנטיות אנושיות לגבהים חדשים, אך היא נותרה אסורה מבחינת עלות. טכנולוגיית ריצוף אקסום שלם (WES) שימשה זה מכבר לאיתור גרסאות גרמלין8 והצליחה לזהות מוטציות של נהגים סומטיים באקסום של סוגי סרטן שונים9. ניתן להשתמש בזיהוי של אקסונים של דנ”א או אזורי קידוד על ידי WES כדי לחשוף גרסאות פתוגניות ברוב המחלות המנדליאניות. כיום, עם העלות הפוחתת של ריצוף, WGS צפוי להפוך לכלי חשוב בחקר הגנומיקה וניתן להשתמש בו באופן נרחב באיתור וריאנטים פתוגניים בגנום.
טכנולוגיית WES שימשה גם בקרדיומיופתיה תורשתית לזיהוי וריאנטים פתוגניים כדי להבהיר עוד יותר את האטיולוגיה. עדויות חדשות מצביעות על כך שגנים המקודדים מוטציות בגנים של חלבונים מבניים של סרקומרה, כגון MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ו-TPM1 18 אחראים לאטיולוגיה הגנטית של HCM. מודעות לווריאנטים פתוגניים בגנים הגורמים למחלות נדירות (למשל, אובסקורין, קלמודולין ציטוסקטלי ו-RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, משחק אלפא 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, וחלבון עשיר בציסטאין וגליצין 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) נקשרה גם היא ל-HCM. מחקרים גנטיים עדכניים זיהו מספר גרסאות פתוגניות שונות בגן החלבון הסרקומרי בכ-40%-60% מחולי HCM, ובדיקות גנטיות בחולי HCM גילו כי רוב הווריאנטים הפתוגניים מתרחשים בשרשרת הכבדה של מיוזין (MYH7) ובחלבון קושר מיוזין C (MYBPC3). עם זאת, הבסיס הגנטי ל-HCM נותר חמקמק. חקירת הפתוגניות של וריאציות אלה העומדות בבסיס חולי HCM אנושיים נותרה אתגר גדול22.
במחקר זה אנו מדווחים על וריאנט פתוגני ב-MYH7 במשפחת האן הסינית עם HCM על ידי WES. על מנת לאמת את הפתוגניות של גרסה זו, הקמנו עכברי נוקין C57BL/6N-Myh7em1(G823E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. אנו דנים גם במנגנונים מתקבלים על הדעת של גרסה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה אנו מתארים משפחה סינית אחת של בני האן עם HCM. ניתוח גנטי גילה כי מוטציה הטרוזיגוטית MYH6 p.G823E מפרידה יחד עם המחלה אצל בני משפחה עם תורשה אוטוזומלית דומיננטית. כדי לאמת את הפתוגניות של מוטציית G823E ולדון במנגנונים הבסיסיים, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם G823E בלוקוס Myh7 של עכבר על ידי הנדסת גנום בת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט קרן המחקר הרפואי של מחוז גואנגדונג (A2022363) והפרויקט הגדול של ועדת גואנגדונג למדע וטכנולוגיה, סין (מענק מס ‘2022).
ברצוננו להודות לצ’ינגג’יאן צ’ן מאוניברסיטת מרילנד, קולג ‘ פארק על העזרה במהלך הכנת כתב יד זה.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
