Onderzoek naar de pathogenese van MYH7-mutatie Gly823Glu bij familiaire hypertrofische cardiomyopathie met behulp van een muismodel
Summary
Op basis van de familiale erfelijke cardiomyopathiefamilie die in ons klinische werk werd aangetroffen, creëerden we een C57BL / 6N-muismodel met een puntmutatie (G823E) bij de MYH7-locus van de muis via CRISPR / Cas9-gemedieerde genoomtechnologie om deze mutatie te verifiëren.
Abstract
Familiaire hypertrofische cardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) is de meest voorkomende cardiomyopathie in China. De onderliggende genetische etiologie van HCM blijft echter ongrijpbaar.
We identificeerden eerder een myosine zware keten 7 (MYH7) gen heterozygote variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), in een grote Chinese Han-familie met HCM. In deze familie cosegregaat variant G823E met een autosomaal dominante aandoening. Deze variant bevindt zich in het hefboomarmdomein van het nekgebied van het MYH7-eiwit en is sterk geconserveerd onder homologe myosines en soorten. Om de pathogeniciteit van de G823E-variant te verifiëren, produceerden we een C57BL/6N-muismodel met een puntmutatie (G823E) bij de MYH7-locus van de muis met CRISPR/Cas9-gemedieerde genoomtechnologie. We ontwierpen gRNA-targetingvectoren en donoroligonucleotiden (met targetingsequenties geflankeerd door 134 bp homologie). De p.G823E (GGG naar GAG) plaats in het donor oligonucleotide werd geïntroduceerd in exon 23 van MYH7 door homologie-gerichte reparatie. Een gedempte p.R819 (AGG naar CGA) werd ook ingebracht om gRNA-binding en hersplitsing van de sequentie na homologie-gerichte reparatie te voorkomen. Echocardiografie onthulde hypertrofie van de linkerventrikel achterste wand (LVPW) met systole bij MYH7 G823E/- muizen op de leeftijd van 2 maanden. Deze resultaten werden eveneens gevalideerd door histologische analyse (figuur 3).
Deze resultaten tonen aan dat de G823E-variant een belangrijke rol speelt in de pathogenese van HCM. Onze bevindingen verrijken het spectrum van MYH7-varianten gekoppeld aan familiale HCM en kunnen richtlijnen bieden voor genetische counseling en prenatale diagnose in deze Chinese familie.
Introduction
Hypertrofische cardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) is de meest voorkomende cardiomyopathie in China, met een geschatte incidentie van 0,2%, die 150.000 mensen 1,2 treft.
Het pathologische anatomische kenmerk dat HCM kenmerkt, is asymmetrische ventriculaire hypertrofie, waarbij vaak het ventriculaire uitstroomkanaal en / of interventriculair septum3 betrokken is. De klinische manifestatie is inspanningsdyspneu, vermoeidheid en pijn op de borst. Het individuele fenotype van HCM heeft variabiliteit variërend van klinisch verraderlijk tot ernstig hartfalen. Patiënten met HCM hebben medische behandeling, harttransplantatie, levensondersteunende apparatuur en multidisciplinaire follow-up nodig4.
In de afgelopen eeuw heeft PCR-technologie de manier veranderd waarop we DNA5 bestuderen. Een DNA-sequencingmethode voor klinische diagnose werd ontdekt door Sanger en collega’s6. De Sanger-techniek werd vervolgens toegepast op het Human Genome Project, maar deze aanpak was kostbaar en tijdrovend7. De komst van whole-genome sequencing (WGS) bracht inzichten in menselijke genetische ziekten naar nieuwe hoogten, maar het bleef onbetaalbaar in termen van kosten. Whole-exome sequencing (WES) technologie wordt al lang gebruikt om kiembaanvarianten8 te detecteren en is succesvol geweest in het identificeren van somatische drivermutaties in het exoom van verschillende kankers9. De detectie van DNA-exonen of coderende regio’s door WES kan worden gebruikt om pathogene varianten in de meeste Mendeliaanse ziekten te onthullen. Vandaag de dag, met de dalende kosten van sequencing, wordt verwacht dat WGS een belangrijk hulpmiddel zal worden in genomica-onderzoek en op grote schaal kan worden gebruikt bij de detectie van pathogene varianten in het genoom.
WES-technologie is ook gebruikt bij erfelijke cardiomyopathie om pathogene varianten te identificeren om de etiologie verder op te helderen. Opkomend bewijs heeft aangetoond dat genen die sarcomeer structurele eiwitgenmutaties coderen, zoals MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117 en TPM118 verantwoordelijk zijn voor de genetische etiologie van HCM. Bewustzijn van pathogene varianten in zeldzame ziekteverwekkende genen (bijv. obscurine, cytoskeletale calmoduline en titine-interacterende RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, werkende alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, en cysteïne en glycinerijk eiwit 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) is ook in verband gebracht met HCM. Huidige genetische studies hebben meerdere verschillende pathogene varianten in het sarcomerische eiwitgen geïdentificeerd bij ongeveer 40% -60% van de HCM-patiënten, en genetische tests bij HCM-patiënten onthulden dat de meeste pathogene varianten voorkomen in de myosine-zware keten (MYH7) en myosine-bindend eiwit C (MYBPC3). De genetische basis voor HCM blijft echter ongrijpbaar. Het onderzoeken van de pathogeniciteit van deze variaties die ten grondslag liggen aan de menselijke HCM-patiënten blijft een grote uitdaging22.
In deze studie rapporteren we een pathogene variant in MYH7 in een Chinese Han-familie met HCM door WES. Om de pathogeniciteit van deze variant te verifiëren, hebben we een C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin muizen vastgesteld met behulp van het CRISPR/Cas9 systeem. We bespreken ook plausibele mechanismen van deze variant.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschrijven we één Chinese Han-familie met HCM. Genetische analyse onthulde dat een heterozygote MYH6-mutatie p.G823E co-segregeert met de ziekte bij familieleden met autosomaal dominante overerving. Om de pathogeniciteit van de G823E-mutatie te valideren en de onderliggende mechanismen te bespreken, hebben we een C57BL/6N-muismodel gemaakt met G823E at mouse Myh7-locus door CRISPR/Cas9-gemedieerde genome engineering.
Fenotypische kenmerken van C57BL/6N-Myh7em1(G823E)</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Medical Research Fund-project van de provincie Guangdong (A2022363) en het grote project van het Guangdong Committee of Science and Technology, China (subsidie nr.2022).
We willen Qingjian Chen van de Universiteit van Maryland, College Park bedanken voor de hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
