Ailesel Hipertrofik Kardiyomiyopatide MYH7 Mutasyonu Gly823Glu'nun Patogenezinin Bir Fare Modeli Kullanılarak İncelenmesi
Summary
Klinik çalışmamızda bulunan ailesel kalıtsal kardiyomiyopati ailesine dayanarak, bu mutasyonu doğrulamak için CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği aracılığıyla fare MYH7 lokusunda bir nokta mutasyonu (G823E) olan bir C57BL / 6N fare modeli oluşturduk.
Abstract
Ailesel hipertrofik kardiyomiyopati (HCM, OMIM: 613690) Çin’de en sık görülen kardiyomiyopatidir. Bununla birlikte, HCM’nin altta yatan genetik etiyolojisi belirsizliğini korumaktadır.
Daha önce HCM’li büyük bir Çin Han ailesinde NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) geninin heterozigot varyantı olan miyozin ağır zincir 7 (MYH7) genini tanımlamıştık. Bu ailede, varyant G823E otozomal dominant bir bozuklukla birlikte ayrışır. Bu varyant, MYH7 proteininin boyun bölgesinin kol kolu alanında bulunur ve homolog miyosinler ve türler arasında oldukça korunmuştur. G823E varyantının patojenitesini doğrulamak için, CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği ile fare MYH7 lokusunda bir nokta mutasyonuna (G823E) sahip bir C57BL / 6N fare modeli ürettik. Vektörleri ve donör oligonükleotidleri hedefleyen gRNA tasarladık (hedefleme dizileri 134 bp homoloji ile çevrili). Donör oligonükleotiddeki p.G823E (GGG’den GAG’ye) bölgesi, homolojiye yönelik onarım ile MYH7’nin ekzon 23’üne sokuldu. Homolojiye yönelik onarımdan sonra gRNA bağlanmasını ve sekansın yeniden bölünmesini önlemek için susturulmuş bir p.R819 (AGG’den CGA’ya) da yerleştirildi. Ekokardiyografide 2 aylıkken MYH7 G823E/- farelerde sistollü sol ventrikül arka duvar (LVPW) hipertrofisi saptandı. Bu sonuçlar da histolojik analizlerle doğrulandı (Şekil 3).
Bu sonuçlar, G823E varyantının HCM’nin patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bulgularımız, ailesel HCM ile bağlantılı MYH7 varyantlarının spektrumunu zenginleştirmekte ve bu Çinli ailede genetik danışmanlık ve doğum öncesi tanı için rehberlik sağlayabilir.
Introduction
Hipertrofik kardiyomiyopati (HCM, OMIM: 613690), Çin’de en sık görülen kardiyomiyopatidir ve tahmini insidansı %0,2 olup, 150.000 kişiyi etkilemektedir 1,2.
HCM’yi karakterize eden patolojik anatomik özellik, sıklıkla ventriküler çıkış yolunu ve / veya interventrikülerseptumu 3’ü tutan asimetrik ventriküler hipertrofidir. Klinik bulgusu eforlu nefes darlığı, yorgunluk ve göğüs ağrısıdır. HCM’nin bireysel fenotipi, klinik olarak sinsilikten ciddi kalp yetmezliğine kadar değişen değişkenliğe sahiptir. HCM’li hastalar tıbbi tedavi, kalp nakli, yaşam destek ekipmanı ve multidisipliner takipgerektirir 4.
Geçtiğimiz yüzyılda, PCR teknolojisi DNA5’i inceleme şeklimizi değiştirdi. Klinik tanı için bir DNA dizileme yöntemi Sangerve meslektaşları 6 tarafından keşfedildi. Sanger tekniği daha sonra İnsan Genomu Projesi’ne uygulandı, ancak bu yaklaşım maliyetli ve zaman alıcıydı7. Tüm genom dizilemesinin (WGS) ortaya çıkışı, insan genetik hastalığına dair içgörüleri yeni zirvelere taşıdı, ancak maliyet açısından engelleyici kaldı. Tüm ekzom dizileme (WES) teknolojisi, germline varyantları8’i tespit etmek için uzun zamandır kullanılmaktadır ve çeşitli kanserlerin ekzomundaki somatik sürücü mutasyonlarını tanımlamada başarılı olmuştur9. DNA ekzonların veya kodlama bölgelerinin WES tarafından tespiti, çoğu Mendel hastalığında patojenik varyantları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Günümüzde dizileme maliyetinin azalmasıyla birlikte, WGS’nin genomik araştırmalarda önemli bir araç haline gelmesi ve genomdaki patojenik varyantların tespitinde yaygın olarak kullanılabilmesi beklenmektedir.
WES teknolojisi, etiyolojiyi daha da aydınlatmak için patojenik varyantları tanımlamak için kalıtsal kardiyomiyopatide de kullanılmıştır. Ortaya çıkan kanıtlar, MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ve TPM1 18 gibi sarkomer yapısal protein gen mutasyonlarını kodlayan genlerin HCM’nin genetik etiyolojisinden sorumlu olduğunu göstermiştir. Nadir hastalığa neden olan genlerdeki patojenik varyantların farkındalığı (örneğin, obscurin, sitoiskeletal kalmodulin ve titin ile etkileşime giren RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, etkili alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 ve sistein ve glisin bakımından zengin protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) de HCM ile ilişkilendirilmiştir. Mevcut genetik çalışmalar, HCM hastalarının yaklaşık% 40-60’ında sarkomerik protein geninde çok sayıda farklı patojenik varyant tanımlamıştır ve HCM hastalarında yapılan genetik testler, çoğu patojenik varyantın miyozin ağır zincirinde (MYH7) ve miyozin bağlayıcı protein C’de (MYBPC3) meydana geldiğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, HCM’nin genetik temeli belirsizliğini korumaktadır. İnsan HCM hastalarının altında yatan bu varyasyonların patojenitesini araştırmak büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir22.
Bu çalışmada, WES tarafından HCM’li Çinli bir Han ailesinde MYH7’de patojenik bir varyant bildirilmiştir. Bu varyantın patojenitesini doğrulamak için, CRISPR / Cas9 sistemini kullanarak bir C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockin fareleri kurduk. Ayrıca bu varyantın makul mekanizmalarını da tartışıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, HCM’li bir Çinli Han ailesini tanımladık. Genetik analiz, heterozigot bir MYH6 mutasyonunun p.G823E’nin otozomal dominant kalıtımlı aile bireylerinde hastalıkla birlikte ayrıldığını ortaya koymuştur. G823E mutasyonunun patojenitesini doğrulamak ve altta yatan mekanizmaları tartışmak için, CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği tarafından fare Myh7 lokusunda G823E ile bir C57BL / 6N fare modeli oluşturduk.
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin far…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Tıbbi Araştırma Fonu projesi (A2022363) ve Çin Guangdong Bilim ve Teknoloji Komitesi’nin (hibe no.2022) ana projesi tarafından desteklenmiştir.
Maryland Üniversitesi, College Park’tan Qingjian Chen’e bu yazının hazırlanması sırasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
