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Biology

Tomografia crioelettronica Raccolta dati remota e media dei sottotomogrammi

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63923
, , ,
1Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics,University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute,University of Oxford

Summary

Il presente protocollo descrive l’acquisizione remota dei dati della tomografia crioelettronica ad alta risoluzione utilizzando Tomo5 e la successiva elaborazione dei dati e la media dei sottotomogrammi utilizzando emClarity. L’apoferritina è usata come esempio per illustrare dettagliati processi passo-passo per ottenere una struttura crio-ET con una risoluzione di 2,86 Å.

Abstract

La tomografia crioelettronica (cryo-ET) ha guadagnato slancio negli ultimi anni, soprattutto dopo l’introduzione di rivelatori di elettroni diretti, strategie di acquisizione automatizzate migliorate, tecniche preparative che espandono le possibilità di ciò che il microscopio elettronico può visualizzare ad alta risoluzione utilizzando crio-ET e nuovi software di media dei sottotomogrammi. Inoltre, l’acquisizione dei dati è diventata sempre più snella, rendendola più accessibile a molti utenti. La pandemia di SARS-CoV-2 ha ulteriormente accelerato la raccolta di dati di crio-microscopia elettronica remota (cryo-EM), in particolare per la crio-EM a singola particella, in molte strutture a livello globale, fornendo agli utenti l’accesso ininterrotto a strumenti all’avanguardia durante la pandemia. Con i recenti progressi in Tomo5 (software per la tomografia elettronica 3D), la raccolta di dati crio-ET remoti è diventata robusta e facile da gestire da qualsiasi parte del mondo. Questo articolo ha lo scopo di fornire una procedura dettagliata a partire dalla configurazione della raccolta dati nel software di tomografia per il processo di una sessione di raccolta dati crio-ET (remota) con risoluzione dettagliata dei problemi. Il protocollo di raccolta dati (remoto) è ulteriormente integrato con il flusso di lavoro per la determinazione della struttura a risoluzione quasi atomica mediante media di sottotomogrammi con emClarity, utilizzando l’apoferritina come esempio.

Introduction

La microscopia elettronica criogenica (crio-EM) è ampiamente nota per aver vissuto un periodo rinascimentale, accelerandolo per diventare uno strumento centrale e centrale utile nella biologia strutturale. Lo sviluppo e l’utilizzo di rivelatori di elettroni diretti 1,2,3, microscopi e sorgenti di elettroni migliorati 3,4,5, miglioramenti nell’automazione/throughput 6,7,8,9 e progressi computazionali nell’analisi di singole particelle10,11,12,13 ,14 e la tomografia15,16,17 sono tutti, in parte, responsabili del recente successo della tecnica. Questi driver tecnologici hanno sviluppato la capacità della crio-EM di risolvere strutture macromolecolari biologiche in condizioni criogeniche e native. Le risoluzioni facilmente ottenibili sono sufficienti per una modellazione atomicamente accurata e hanno portato la tecnica alla ribalta nell’arena della biologia strutturale. Un approccio riduzionista per esprimere e purificare un bersaglio biologico di interesse si è da tempo dimostrato efficace nella cristallografia macromolecolare (MX) per la ricerca biologica di base, la scoperta di farmaci e la scienza traslazionale. Con lo stesso approccio, la crio-EM può ora fornire risultati paralleli agli studi MX ad alta risoluzione. L’attuale grande successo nel ramo crio-EM della biologia strutturale è chiamato analisi a singola particella (SPA), che acquisisce immagini di proiezione 2D tipicamente di un campione di proteina purificata18 per ottenere migliaia di viste di una macromolecola biologica19. Queste immagini (1) contengono informazioni provenienti da una serie di viste che rappresentano pienamente gli orientamenti del target nello spazio 3D e (2) catturano l’eterogeneità conformazionale dell’oggetto, che può essere successivamente separata e studiata.

Un approccio alternativo all’acquisizione di queste immagini di proiezione 2D di campioni biologici, anche in situ e senza purificazione, è la tomografia crioelettronica (cryo-ET). Cryo-ET scatta una serie di immagini dello stesso oggetto ad angoli inclinati ruotando meccanicamente il campione. Pertanto, le proiezioni 2D raccolte in SPA, che rappresentano le pose angolari della molecola di interesse, sono intrinsecamente raccolte come parte dell’esperimento di imaging crio-ET20. Le serie di inclinazioni tomografiche vengono quindi ricostruite in un tomogramma che contiene rappresentazioni 3D dei complessi macromolecolari ripresi. La natura della raccolta di dati tomografici diminuisce, in una certa misura, la dipendenza dalla media per ottenere una rappresentazione 3D completa di una molecola da una raccolta di immagini 2D. Tuttavia, a causa degli attuali progetti di stadio, il campione è tipicamente inclinato da -60 ° a + 60 °, lasciando un cuneo mancante21 di informazioni nella ricostruzione tomografica 3D.

Le ricostruzioni 3D in un singolo tomogramma hanno quindi un cuneo mancante di informazioni e un basso segnale al rumore. Le singole macromolecole possono essere estratte come sottotomogrammi e mediate insieme per affrontare questo problema. Dove ogni macromolecola in un sottotomogramma si trova con un orientamento diverso, il cuneo mancante è orientato in modo diverso in ogni sottotomogramma dell’oggetto bersaglio, quindi la media su molte copie riempie le informazioni a causa del cuneo mancante. I recenti sviluppi nell’elaborazione delle immagini hanno anche tentato di addestrare le reti neurali di intelligenza artificiale a riempire il cuneo mancante con dati significativi22. Questo processo di calcolo della media aumenta anche il rapporto segnale/rumore, simile all’obiettivo di fare la media nell’analisi delle singole particelle, in modo da migliorare la qualità e la risoluzione della ricostruzione. Se la molecola di interesse possiede simmetria, anche questa può essere definita e impiegata durante la media, migliorando ulteriormente la risoluzione della ricostruzione. L’estrazione di volumi 3D di una macromolecola da un tomogramma in un insieme di sottotomogrammi e la loro successiva elaborazione è nota come subtomogramma averaging (STA)23. Laddove ogni subtomogramma rappresenti una copia unica della molecola studiata, qualsiasi eterogeneità strutturale può essere interrogata utilizzando il flusso di lavoro STA. Come comunemente utilizzato nel flusso di lavoro SPA, le tecniche di classificazione possono essere impiegate durante STA per sezionare gli stati conformazionali del complesso di interesse. Oltre a consentire la ricostruzione ad alta risoluzione in crio-ET, questo approccio rende la tecnica un potente strumento per interrogare i meccanismi strutturali delle macromolecole nel loro ambiente cellulare nativo o di bersagli spesso non suscettibili di SPA24,25,26.

La tomografia elettronica ha una lunga storia di determinazione dell’ultrastruttura 3D di campioni cellulari a temperatura ambiente27. L’acquisizione di viste mediante inclinazione fisica del campione fornisce informazioni sufficienti per la ricostruzione 3D di un oggetto su scale di lunghezza cellulare ed è particolarmente importante quando le strutture cellulari non hanno la regolarità per la media. Le cellule possono anche essere congelate su substrati per l’imaging crio-ET ai bordi delle cellule dove il campione è abbastanza sottile da essere trasparente agli elettroni. In queste condizioni, STA può essere impiegato per determinare le strutture macromolecolari in un ambiente cellulare, anche se quando il campione è abbastanza sottile da essere trasparente agli elettroni28. Tuttavia, se combinato con ulteriori tecniche preparative, tra cui la microscopia crio-correlativa a luce ed elettronica (cryo-CLEM) e la fresatura a fascio ionico focalizzato (cryo-FIB), la crio-ET può essere utilizzata per visualizzare immagini all’interno di cellule intere in condizioni criogeniche29. Questo unisce il potere della crio-ET per studiare l’ultrastruttura cellulare con la potenza di STA per determinare le strutture dei complessi macromolecolari in situ identificando la loro posizione cellulare30 e fornendo istantanee di complessi impegnati in processi dinamici31. La capacità della tecnica di visualizzare campioni cellulari e impiegare STA in diversi studi ha evidenziato la potenza della tecnica per risolvere strutture macromolecolari in situ, anche a risoluzioni paragonabili a SPA32. Un ulteriore beneficio si riscontra nella conoscenza della posizione originaria della macromolecola, rappresentata dalla ricostruzione 3D classificata finale nel tomogramma30. Pertanto, la struttura macromolecolare può essere correlata con l’ultrastruttura cellulare. Queste osservazioni su scale di lunghezza porteranno presumibilmente a risultati importanti in cui i meccanismi strutturali possono essere correlati con i cambiamenti cellulari nel contesto degli studi funzionali.

Cryo-ET e STA consentono la raccolta dei dati in tre flussi di lavoro principali: tomografia molecolare, cellulare e lamellare. Le strutture dei complessi macromolecolari purificati possono essere determinate mediante crio-ET mediante tomografia molecolare. Determinare le strutture proteiche nel loro ambiente cellulare in cui la cellula è abbastanza sottile può essere descritto come tomografia cellulare. Più recentemente, con lo sviluppo del targeting criogenico e della macinazione, queste stesse tecniche possono essere applicate nei flussi di lavoro della tomografia a lamella per determinare le strutture proteiche profonde all’interno della cellula nel loro ambiente nativo, rivelando il contesto cellulare in cui tali proteine sono osservate. È possibile utilizzare diverse strategie di raccolta dati a seconda dei pacchetti software disponibili e, soprattutto, a seconda delle esigenze del campione. I campioni molecolari o non aderenti su una griglia TEM di rame di una proteina purificata richiedono in genere meno manipolazione e, quindi, rimangono piatti e non danneggiati nei casi ideali. I tomogrammi elettronici possono essere facilmente impostati in serie su una griglia holey-carbonio per acquisire rapidamente da decine a centinaia di tomogrammi in modo sistematico. Il modo più semplice per gli utenti di impostare campioni di tomografia molecolare in cui le proteine sono abbondantemente presenti sulla griglia sarebbe quello di utilizzare Tomo5 (software per la tomografia elettronica 3D utilizzato nel presente studio, vedi Tabella dei materiali). Sono disponibili anche altri software di tomografia come Leginon9 e serialEM6; Offrono più opzioni di configurazione per approcci più personalizzati per la raccolta dei dati, ma sono più complessi e di conseguenza possono essere più difficili da navigare, in particolare per gli utenti nuovi alla tomografia e gli utenti che accedono alla loro sessione da remoto. Per una struttura con una base di utenti ampia e diversificata, Tomo5 è facile da utilizzare in un ambiente remoto e da addestrare gli utenti. Per le celle aderenti, le griglie richiedono in genere più passaggi di gestione e la necessità di utilizzare fragili griglie d’oro aumenta la necessità di una maggiore cura nella gestione e nelle strategie di raccolta dei dati. Per facilitare la ricerca di una regione cellulare di interesse ed evitare l’occlusione dalla griglia stessa ad angoli di inclinazione elevati, è anche utile utilizzare maglie di dimensioni maggiori, ma al costo che siano intrinsecamente più fragili. Per i campioni di lamelle, la fragilità del campione è determinata dalla qualità della lamella, che può essere variabile. Questi fattori aumentano i tempi di configurazione e le considerazioni, ma la maggiore adattabilità e robustezza rendono Tomo5 adatto a questo tipo di raccolta dati. Tuttavia, esistono scenari di raccolta dati specializzati per ogni flusso di lavoro. BISECT e PACE-tomo (entrambi eseguiti in SerialEM) introducono la possibilità di uno spostamento del fascio di immagini durante l’acquisizione della tomografia per aumentare la velocità di raccolta del tomogramma28, in particolare nella tomografia molecolare. I montaggi a medio ingrandimento (MMM) in SerialEM 6,7,33 possono identificare meglio e indirizzare con precisione le caratteristiche molecolari in tutti i flussi di lavoro, anche se, al momento della scrittura, queste funzionalità stanno iniziando a essere implementate in Tomo5.

Come SPA, cryo-ET e STA stanno diventando sempre più accessibili attraverso i miglioramenti apportati al software di acquisizione e una vasta gamma di pacchetti disponibili per subtomogrammi con una media di 16,17,32,34,35,36,37,38. Inoltre, durante la pandemia, consentire l’accesso remoto alla strumentazione crio-EM è diventato essenziale per il funzionamento continuo di strutture nazionali come l’Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) presso Diamond Light Source (DLS), Regno Unito. Questi sviluppi hanno reso la crio-ET più accessibile e robusta per i ricercatori che desiderano utilizzare la tecnica. Una volta acquisiti i dati, STA è uno strumento essenziale per analizzare oggetti ricorrenti per ottenere la massima risoluzione di ricostruzione e consentire la classificazione dell’eterogeneità macromolecolare. L’attuale protocollo mira a fornire una procedura dettagliata della preparazione di un microscopio crio-TEM per la raccolta dei dati crio-ET e di come eseguire la media dei sottotomogrammi utilizzando emClarity su un set di dati di tomografia molecolare di apoferritina come esempio. L’uso di emClarity (software per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione e la media dei sottotomogrammi, vedi Tabella dei materiali) richiede l’esecuzione di script dalla riga di comando, quindi si presuppone un livello di familiarità con i sistemi Linux / UNIX.

La connessione remota dipende dall’ambiente di rete in ciascun istituto/struttura. In eBIC, il sistema remoto utilizza programmi che consentono la raccolta remota dei dati sulla specifica configurazione di rete utilizzata da Diamond. La connessione remota al microscopio è facilitata da due piattaforme: NoMachine e TeamViewer (vedi Tabella dei materiali). Utilizzando il programma NoMachine, l’utente può accedere a un desktop remoto di Windows. Il desktop remoto di Windows fornito da NoMachine risiede sulla stessa rete del microscopio e, quindi, funge da PC di supporto virtuale al microscopio. Dal PC di supporto virtuale, l’utente si collega al microscopio tramite TeamViewer fornendo accesso diretto e controllo al PC del microscopio che esegue TUI e Tomo.

Il presente protocollo si compone di due parti (fase 1 e fase 2). La fase 1 si concentra sull’acquisizione remota dei dati cryo-ET utilizzando Tomo5 (software per la tomografia elettronica 3D). Il walk-through per una sessione (remota) cattura le immagini a ingrandimenti sempre più elevati per consentire all’utente di dirigere il software di tomografia verso le aree dei campioni per la raccolta dei dati tomografici. Nella Figura 1 viene riepilogato questo processo. La fase 2 descrive in dettaglio l’elaborazione dei dati cryo-ET STA utilizzando emClarity (software per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione e la media dei sottotomogrammi). Nella Figura 9 viene riepilogato questo processo.

Il protocollo è destinato a un pubblico remoto. Presuppone che la persona fisicamente al microscopio e che carichi i campioni abbia eseguito gli allineamenti diretti e si sia occupata della sintonizzazione della fotocamera e dell’acquisizione dei riferimenti di guadagno. Per questo protocollo, si presume un sistema di lenti a tre condensatori con un caricatore automatico. Per ulteriori linee guida dettagliate sul software di tomografia, un manuale dettagliato del produttore è disponibile nel pulsante Start di Windows da cui è stato caricato il software.

Protocol

I pacchetti software utilizzati in questo studio sono in parte liberamente disponibili (vedi Tabella dei materiali). 1. Acquisizione dati crio-ET remota tramite Tomo5 Se il software non è caricato, iniziare avviandolo dal PC server TEM (vedere Tabella dei materiali). Eseguire i controlli iniziali e configurare la condizione di imaging selezionando Predefiniti.Avviare la configurazione della sessione regolando i parametri di acquisizione dell’immagine nella scheda “Preparazione” sotto Preset (Figura 2A,B).Regolare l'”Ingrandimento della panoramica” per adattarlo alle dimensioni e alla dose del quadrato della griglia per ottenere conteggi adeguati.NOTA: se l’ingrandimento appropriato è sconosciuto per il tipo di griglia, tornare a questo passaggio dopo aver caricato una griglia. “Altezza eucentrica” e “Ingrandimento di ricerca” possono essere la stessa cosa. Fare clic su Cerca nella scheda “Tomografia” per impostare le posizioni e assicurarsi che l’ingrandimento sia sufficiente per mostrare il segno distintivo di interesse e per adattarsi all’area “Esposizione” e “Tracciamento / Messa a fuoco” nel campo visivo (Figura 2C). Imposta “Ingrandimento dell’esposizione” sulla dimensione dei pixel desiderata. Se questo è sconosciuto, stabilirlo regolando l’ingrandimento al campo visivo desiderato per adattarlo alla regione di interesse. Copiare i parametri di acquisizione dell’immagine (Esposizione) in tutti gli altri preset ad alto ingrandimento (Tracking, Drift, Focus, Thon Ring, Zero Loss,). Per fare ciò, premere Set per impostare “Esposizione” al microscopio e ottenere le “Impostazioni di esposizione” a tutti gli altri ingrandimenti elevati dopo averli selezionati singolarmente.Regolare i tempi di esposizione, in particolare per “Focus” e “Tracking” per dare un numero appropriato di conteggi, considerando anche lo spessore a 60°, cioè sia a 0° che a 60°, affinché abbastanza elettroni passino attraverso il campione per fornire un segnale forte per la correlazione incrociata.NOTA: Come stima, i tempi di esposizione per “Tracking” e “Focus” uguali ai preset “Exposure” sono una buona prima misura. Per un esempio di calcolo della dose per il preset “Esposizione”, vedere la Figura 3. Impostare il tempo di esposizione calcolato per il preset “Esposizione” nella scheda “Preparazione”. Regolare il “Zero Loss Preset” per utilizzare una dimensione dello spot più luminosa e più grande (una dimensione dello spot più grande corrisponde a un numero più piccolo), poiché ciò richiede una dose più elevata.NOTA: questa impostazione predefinita viene utilizzata al meglio per allineare la fessura del filtro di energia, se presente sul microscopio. Esegui la raccolta dell’atlante seguendo i passaggi seguenti.Per raccogliere un atlante, fare clic su Nuova sessione nella scheda “Atlante”, impostare le preferenze di sessione , inserire il percorso di memorizzazione e il formato di output e premere Applica. Selezionare Screening (Figura 4) e quindi spuntare tutti gli atlanti da acquisire. Selezionare Close Col Valves per lasciare il microscopio senza supervisione; Questo chiuderà le valvole della colonna dopo che tutti gli atlanti selezionati sono stati raccolti. Per avviare lo screening, premere il pulsante Start . Ispezionare gli atlanti singoli o multipli per le destinazioni facendo clic sulla griglia nel pannello di sinistra sotto “Screening” (Figura 4), quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare il mouse per spostarsi e scorrere al centro per ingrandire e rimpicciolire. Scegli la griglia per la configurazione di destinazione, selezionala e fai clic su Carica campione dall’interno del software. Per le calibrazioni dello spostamento dell’immagine, continuare a utilizzare la scheda di screening dell’atlante per navigare all’interno della griglia caricata. Trova una caratteristica identificabile che sarà riconoscibile in tutti i preset di ingrandimento, cioè un cristallo di ghiaccio che si sovrappone a un bordo di un foro o a un’altra caratteristica riconoscibile (Figura 5). Spostati su quel quadrato con un clic destro del mouse, quindi “Sposta stage su Grid Square”.NOTA: lo stadio deve essere all’altezza eucentrica per implementare correttamente le calibrazioni dello spostamento dell’immagine. Eseguire la calibrazione dello spostamento dell’immagine.Nella scheda “Funzioni automatiche” (Figura 6), impostare il preset su “Altezza eucentrica”, passare a “Auto-Eucentric by Stage Tilt” e premere Start. Monitorare la finestra di stato per assicurarsi che la ricerca dell’altezza eucentrica abbia successo e tenere d’occhio le immagini di inclinazione positiva e negativa; devono correlare.NOTA: Dalla versione 5.8 del software Pomodoro, il criterio per l’accettazione eucentrica dell’altezza può essere modificato; Il valore predefinito è 0,25 μm e impostandolo su 0,5-0,8 μm offre più margine di manovra. I valori dipendono dalle prestazioni del microscopio, ma si raccomanda che siano il più piccoli possibile.Quando sei ad altezza eucentrica e a fuoco, centra il palcoscenico su una caratteristica. Raccogli un’anteprima utilizzando il predefinito “Atlas”. Imposta tutti i “Preset” dalla scheda “Preparazione”. Successivamente, aumentare l’ingrandimento alla funzione Panoramica > centrale > Anteprima, quindi ripetere “Ingrandimento ricerca” e, infine, “Ingrandimento esposizione”. Se la funzione è rimasta centrata durante il targeting, ignorate le calibrazioni dello spostamento dell’immagine. Altrimenti, per calibrare lo spostamento dell’immagine, vai alla scheda “Preparazione”, seleziona Calibra spostamento immagine e premi Start (Figura 5). In questo modo verranno allineati in modo iterativo gli ingrandimenti inferiori alla feature centrata sull’ingrandimento dell’esposizione.NOTA: se l’iniziale preimpostazione “Esposizione” non è centrata in questa fase, per la recente operazione, il software utilizzerà lo spostamento di fase solo per questo passaggio.Premere Proceed per il preset “Esposizione”. La prossima immagine mostrata sarà il “Preset di ricerca”. Per calibrare lo spostamento dell’immagine tra i predefiniti, fare doppio clic con il pulsante sinistro del mouse nell’anteprima “Cerca” fino al punto centrale dell’anteprima “Esposizione”, quindi premere Riacquista (Figura 5). Fare clic su Procedi per passare alla coppia successiva di preset.NOTA: se durante questa calibrazione è stato applicato uno spostamento dell’immagine all’ingrandimento dell’atlante, assicurarsi di riacquisire l’atlante dopo che la calibrazione dello spostamento dell’immagine è stata completata. Selezionare l’atlante desiderato e premere Ripristina selezionato nel pannello superiore della scheda “Atlante”. Conferma e inizia ad acquisire di nuovo quell’atlante. Eseguire l’impostazione della tomografia.Creare l’impostazione di raccolta dei dati di tomografia nella scheda “Tomografia”.NOTA: Se non diversamente specificato, la configurazione viene eseguita interamente nella scheda “Tomografia”. Avviare una nuova sessione. In “Impostazione sessione” per i campioni biologici, scegliere Slab-like come tipo di campione e selezionare Batch e Low Dose, selezionare il formato di output e la cartella di archiviazione, aggiungere facoltativamente un destinatario e-mail, quindi premere Applica.NOTA: una voce di menu “Posizioni batch” diventa ora disponibile (Figura 7A). L’atlante attualmente caricato viene importato automaticamente. “Panoramica” e “Cerca immagini” possono essere acquisiti e rivisitati fino all’acquisizione di una nuova immagine. Inoltre, dalla versione 5.8, le mappe di ricerca di 3 x 3, 4 x 4 e 5 x 5 riquadri possono essere acquisite con “Acquisisci mappa di ricerca” per facilitare la ricerca e la configurazione del target. Corrispondono a una versione di montaggi a medio ingrandimento. Per impostare gli obiettivi, vai alla “freccia dell’Atlante”, trova una regione di interesse e spostati lì selezionando le opzioni che appaiono con un clic destro del mouse. Scatta un’immagine panoramica per confermare una buona posizione per la regolazione eucentrica dell’altezza, quindi premi su Auto Eucentric; Questo eseguirà la routine eucentrica per inclinazione del palcoscenico. Quindi, riacquista una nuova immagine panoramica per aggiornare l’altezza eucentrica.NOTA: il pulsante “Auto Focus” non dovrebbe essere necessario se la posizione è ad altezza eucentrica. Se l’immagine dell’altezza eucentrica appare molto sfocata, probabilmente l’altezza eucentrica non è corretta e deve essere rifatta (per la risoluzione dei problemi di altezza eucentrica, vedere la sezione di discussione). Controllare il target utilizzando il preset “Overview” prima di impostare la prima posizione; selezionare il preset “Panoramica” e inclinare il palco a ±60° per verificare a quale distanza dalle barre della griglia possono essere impostate le posizioni (Figura 8). A tale scopo, immettere il valore dell’angolo di inclinazione desiderato nella finestra “Imposta inclinazione” (Figura 8A). Ispezionare il quadrato “Panoramica” o la “Mappa di ricerca” acquisita, spostarsi in una regione di interesse e premere Acquisisci ricerca. Ispeziona l’immagine “Cerca”. Se l’area di interesse non è centrata, fare clic con il pulsante destro del mouse nella posizione desiderata, quindi ripetere Sposta fase qui e Acquisisci immagine. Impostare Inclinazione (°) su 0,00 (o qualsiasi altro angolo iniziale che lo stage può gestire) per definire l’angolo iniziale del tomogramma.Per il primo tomogramma, immettere il Nome per la convenzione di denominazione del tomogramma desiderato e la sfocatura per impostare il valore di sfocatura desiderato per ciascun tomogramma. Opzionalmente, dalla versione 5.8 di Tomo in poi, i valori di sfocatura possono essere sistematicamente modificati in una volta sola; per questo, fare clic su Seleziona posizioni, selezionare le posizioni da modificare o spuntare il segno di spunta per selezionare tutte le posizioni, quindi fare clic su Aggiorna sfocatura e regolare i parametri (Figura 7A). Regolare l’area “Focus” e “Tracking” (Figura 2C). Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per trascinare le aree di tracciamento e messa a fuoco (cerchi gialli e blu). Assicurarsi che l’area di tracciamento / messa a fuoco sia (principalmente) sul carbonio o su un’altra caratteristica di tracciamento adatta, cioè una caratteristica simile alla regione di interesse; Evitare crepe, contaminazione da ghiaccio, regioni eccessivamente spesse e fori vuoti.Quando si sceglie il carbonio bianco senza molte funzioni di tracciamento, assicurarsi che l’area inizi a bruciare a metà del tomogramma scegliendo una dose abbastanza alta per la messa a fuoco e tracciando per bruciare lentamente il campione a inclinazioni più elevate. Questo può essere utile per mantenere la precisione del tracciamento. Assicurarsi che l’area di tracciamento/messa a fuoco non esponga un’area di acquisizione successiva.NOTA: Prestare attenzione a ciò che è vicino e ciò che entrerà nel raggio. Evita le aree con caratteristiche che interverranno con il tracciamento e/o l’esposizione, comprese le barre della griglia. Premere Aggiungi posizione una volta impostati tutti i parametri e definita la regione di interesse desiderata e “Focus” e “Tracking”. Ripetere l’operazione per i nuovi obiettivi.NOTA: Per verificare che l’altezza eucentrica sia calibrata correttamente per le posizioni batch che sono state impostate, sono disponibili diverse strategie. Si consiglia di sceglierne uno in base al tipo di sessione di tomografia eseguita (molecolare, cellulare, lamellare). Per la tomografia molecolare, supponendo che le griglie siano abbastanza piatte e che l’altezza eucentrica sia stata eseguita al centro di ogni quadrato contenente le posizioni target, saltare la procedura “Perfeziona tutto” (o Perfeziona selezione se sono state selezionate posizioni, Figura 7A). Se Tomo ha difficoltà con la routine di inclinazione auto-eucentrica per palcoscenico, possibilmente fai clic su Salta eucentrico.Per i campioni cellulari o lamelle, ogni posizione del lotto può essere ad un’altezza z diversa. Usa “Perfeziona tutto” per essere cauto o non spuntare l’opzione “Salta eucentrico”.NOTA: “Perfeziona tutto” itererà tutti i tomogrammi che sono stati impostati o selezionati tramite “Seleziona posizioni”; Perfeziona l’altezza eucentrica ed esegui il tracciamento e la messa a fuoco prima dell’acquisizione dei dati. Questa procedura può esporre qualsiasi esposizione sovrapposta dalla successiva regione di messa a fuoco/tracciamento del tomogramma (Figura 7B), che deve essere considerata prima di procedere. Controlla e rivisita le piazze che hanno fallito il perfezionamento. Con il tasto destro del mouse, fare clic sulla posizione fallita per visualizzare le opzioni. Se l’altezza eucentrica fallisce, trova “Auto-eucentric by stage-tilt” (passo 1.4.1.), acquisisci una nuova immagine “Cerca” per aggiornare l’altezza z e “Aggiungi posizione”. Eliminare la posizione non riuscita/inizializzata in precedenza. Fai clic sull’opzione Salta eucentrico , che è stata eseguita con “Perfeziona tutto”.NOTA: se “Rifinisci tutto” non viene eseguito, “Salta eucentrico” non deve essere selezionato. Tomo5 eseguirà la raffinazione eucentrica prima che ogni tomogramma venga acquisito; In questo modo, le posizioni che falliscono il perfezionamento eucentrico saranno saltate. Eseguire le funzioni automatiche seguendo i passaggi seguenti.Controlla le impostazioni per eseguire gli allineamenti tramite la scheda “Funzioni automatiche” navigando nell’atlante verso un’area di carbonio. Porta quell’area all’altezza eucentrica e segui l’ordine degli allineamenti come indicato di seguito.Esegui l’inclinazione auto-eucentrica dello stage con il preset “Eucentric Height”. Eseguire la routine di messa a fuoco automatica con il preset “Focus”. Esegui la routine Autostigmate con il preset “Thon Ring”. Esegui la routine Autocoma con il preset “Thon Ring”. Inserire l’apertura dell’obiettivo desiderata (Figura 6B), probabilmente l’apertura di 100 μm, come buon compromesso per un maggiore contrasto del campione e solo un piccolo cut-off nel segnale ad altissima risoluzione. Ripetere la routine Autostigmate dopo l’inserimento dell’apertura.NOTA: a ingrandimenti con dimensioni dei pixel intorno a 3 Å e risoluzioni inferiori, la routine Autocoma potrebbe non riuscire; in questo caso, selezionare e allineare Tomo Rotation Center sotto Direct Alignments nell’interfaccia utente TEM. Controlla che la routine di centratura Auto Zero-Loss funzioni sul tuo campione. Con il preimpostato “Zero Loss” a una dose ragionevolmente elevata (passo 1.2.3), la routine in Auto Functions avrà più probabilità di successo. Eseguire la raccolta dei dati.Per avviare l’acquisizione automatica nella scheda “Tomografia”, selezionare la lastra di acquisizione dati e impostare i parametri desiderati (Figura 7C). Impostare i parametri di acquisizione dati: Passo inclinazione (°), Max. Angolo positivo (°), Max. Angolo negativo (°), schema di tracciamento (consigliato: selezionare Traccia/Messa a fuoco prima dell’acquisizione). Selezionare Chiudi valvole colonna per lo schema di altezza eucentrica.NOTA: i parametri utilizzati raramente sono “Regola tempo di esposizione”, “Regola ZLP”, “Usa piastra di fase” e “Pausa dopo l’inclinazione”.Utilizzare l’opzione Regola tempo di esposizione per tomogrammi non destinati a STA per aumentare il tempo di esposizione a un rapporto specificato a inclinazioni più elevate. L’opzione Regola ZLP eseguirà un perfezionamento ZLP dopo ogni tomogramma, indipendentemente dalla periodicità impostata. È lento, occasionalmente fallisce senza ovvi motivi e salterà l’acquisizione di quella posizione. Tuttavia, può essere utile per una fessura molto stretta, cioè 3-5 eV su un filtro Selectris(X). Use Phase Plate è usato raramente dall’introduzione dei DED con filtri energetici. Pause After Tilt mette in pausa l’acquisizione ma non consente alcuna modifica nel software. Ricontrollare i parametri di raccolta dei dati (nella scheda “Preparazione”), concordare con il calcolo della dose e lo schema di inclinazione desiderato, specificare il numero di frazioni (Nr.) nel preset “Esposizione”, quindi iniziare l’acquisizione.NOTA: Il numero di frazioni dipende dal campione, dai parametri di acquisizione e dalle fasi di post-elaborazione pianificate, ovvero STA vs. analisi morfologica, e deve essere mantenuto a valori in cui la correzione del movimento e la stima CTF ottengono un segnale sufficiente. Un intervallo di 4-10 frazioni è una buona stima, dove 4 è più adatto per campioni più spessi e 10 per campioni molecolari più sottili.Quindi, fare clic su Avvia per iniziare la raccolta dei dati e monitorare la prima acquisizione del tomogramma per assicurarsi che i tomogrammi vengano acquisiti come previsto.NOTA: Le versioni recenti del software di tomografia hanno una lastra aggiuntiva di Movie Player nella scheda “Tomografia” in cui è possibile guardare i tomogrammi acquisiti. Sii paziente durante il processo di caricamento. 2. Cryo-ET STA di apoferritina usando emClarity NOTA: Qui, il software emClarity17 viene utilizzato per illustrare la determinazione della struttura crio-ET da parte di STA. La Figura 9 riassume questo processo. Sei serie di inclinazione di apoferritina (EMPIAR-10787) sono state prese come esempio. È stata applicata la simmetria ottaedrica e la mappa finale ha avuto una risoluzione di 2,86 Å, ottenuta da sole 4.800 particelle e vicina alla frequenza di Nyquist (2,68 Å). Assicurarsi che il pacchetto software emClarity39 sia scaricato e installato (vedere Tabella dei materiali). Installare IMOD per l’elaborazione del software40.NOTA: è richiesta una conoscenza di base dei comandi Linux. Un tutorial più dettagliato può essere trovato nel riferimento41, che prende un set di dati ribosomi (EMPIAR-10304) come esempio e descrive le procedure passo-passo. Per diversi tipi di campioni proteici, è disponibile anche un rapporto pubblicato in precedenza42. Preparare i file e le directory di input.NOTA: i fotogrammi grezzi sono stati corretti dal movimento da MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (vedere Tabella dei materiali). Le immagini con correzione del movimento sono state impilate per generare la serie tilt-series utilizzando newstack (IMOD) e allineate manualmente con il tracciamento delle patch utilizzando Etomo (vedere Tabella dei materiali), seguite da emClarity. Per ottenere migliori allineamenti, si consiglia di eseguire offset e compensazione dell’inclinazione in Etomo. Le sei serie tilt sono rinominate da TS1 a TS6. Di seguito sono riportate le istruzioni e i comandi per la prima serie di inclinazione (TS1) come esempio.Stabilire una cartella di progetto.NOTA: la versione più recente del software è 1.5.3.11. Tutti i registri software correlati si trovano nella cartella del progetto locale (…/logFile/emClarity.logfile). Nella cartella del progetto, creare un’altra nuova cartella, “fixedStacks”, e preparare i file di input: TS1.fixed, TS1.xf e TS1.tlt.NOTA: TS1.fixed: la serie tilt originale, nota anche come TS1.st in Etomo. TS1.xf: questo file contiene le coordinate di trasformazione dopo Etomo tiltalign. TS1.tlt: questo file contiene gli angoli di inclinazione. Stimare la sfocatura seguendo i passaggi seguenti.Calcola la sfocatura. Aggiornare il file dei parametri con i parametri del microscopio e dell’imaging seguendo la tabella supplementare 1. Copiare un file di parametri nella cartella del progetto, modificarne il nome in param_ctf.m ed eseguire: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.Nota : il modello di file di parametro è disponibile nel file supplementare 1 o nella directory di installazione del software locale (…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/). Controllare i risultati della stima CTF per ogni stack.Controlla gli stack allineati (ad esempio, aliStacks / TS1_ali1.fixed) usando 3dmod e assicurati che le perle fiduciali vengano cancellate correttamente. Assicurarsi che il file di registro riporti che la manualità è corretta, disponibile in logfile/emClarity.logfile (Figura 9). Controlla il valore di sfocatura (ad esempio, fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) e assicurati che corrisponda alla stima teorica CTF. Definire le sottoregioni.Generare un tomogramma binned. Nella cartella del progetto, esegui: sh recScript2.sh -1.NOTA: Un tomogramma più piccolo (di dimensioni) per ogni pila verrà memorizzato in una nuova cartella “bin10”. Per accelerare il processo, le coordinate di una o più sottoregioni possono essere definite in un tomogramma bin10. Il file di script si troverà nella directory di installazione del software locale (…/emClarity_1.5.3.11/docs/). Determinare i limiti scegliendo sei punti, x min, x max, y min, y max, zmin e z max, per creare una sottoregione. Nella cartella “bin10”, esegui: 3dmod TS1_bin10.rec.NOTA: se devono essere create quattro sottoregioni in una serie di inclinazioni, scegliere 6 × 4 = 24 punti. Ogni stack deve avere un file di modello (*.mod) nella cartella “bin10”. Convertire i file di modello nel formato emClarity. Questo creerà una nuova cartella di ricognizione. Memorizza tutte le coordinate di ogni sottoregione in questa cartella. Nella cartella del progetto, eseguire: sh recScript2.sh TS1. Scegli le particelle.Trova un modello di apoferritina per raccogliere le particelle. Scaricare un modello dalla banca dati di microscopia elettronica (EMD-10101)44. Assicurati che la dimensione in pixel del modello corrisponda a quella dei dati non elaborati. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu. Genera tomogrammi corretti CTF per la raccolta delle particelle. Nella cartella del progetto, esegui: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch. Eseguire il prelievo delle particelle per ogni sottoregione. Per il set di dati dell’apoferritina, eseguire una ricerca nel modello in bin6. Modificare i parametri di Tmp_angleSearch (θ out, Δout, θ in, Δ in) per determinare l’intervallo di angoli e gli intervalli per la ricercain gradi nel piano o fuori dal piano. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.NOTA: in questo passaggio verrà generata una cartella “convmap_wedge_Type2_bin6”. Il file csv in questa cartella (ad esempio, TS1_1_bin6.csv) include tutte le informazioni sulle particelle raccolte. Rimuovere le particelle errate utilizzando 3dmod. Nella cartella “convmap_wedge_Type2_bin6”, esegui: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.NOTA: è comune trovare particelle sbagliate accanto ai bordi di carbonio o contaminazioni da ghiaccio in quelle aree. Eseguire un clic destro del mouse sui punti errati e premere backspace sulla tastiera per eliminarli. In questo passaggio, assicurarsi che la maggior parte dei punti falsi positivi venga rimossa (Figura 10). Cambia il nome della cartella “convmap_wedge_Type2_bin6” in “convmap”, poiché emClarity andrà a trovare informazioni sulla sub-regione sotto convmap nei seguenti passaggi. Inizializzare il progetto. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity init param0.m, per creare un database per emClarity, ApoF.mat. Eseguire la ricostruzione dei tomogrammi prima della STA e dell’allineamento. Per generare tomogrammi di sottoregioni corretti per CTF in bin4, eseguire: emClarity ctf 3d param0.m.NOTA: i tomogrammi corretti per CTF (ad esempio, cache/TS1_1_bin4.rec)  verranno generati in una nuova cartella “cache”. Eseguire STA e allineamento.Effettuare la media utilizzando i sottotomogrammi corretti CTF a partire da bin4. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment. Continuare a eseguire gli allineamenti ed eseguire: emClarity alignRaw param0.m 0.NOTA: il passo di calcolo della media genera un riferimento, che verrà utilizzato da emClarity in questo passaggio per allineare le particelle. I parametri Raw_angleSearch (θ out, Δout, θ in, Δin) possono essere modificati per impostare l’intervallo di angoli e le dimensioni dei passi per ogni ciclo. Poiché la maggior parte delle particelle errate vengono rimosse dal database (Passo 2.6.4), queste impostazioni angolari per l’allineamento possono iniziare con un grado relativamente piccolo. Aggiornare i parametri Raw_angleSearch ed eseguire alcuni cicli aggiuntivi (passaggi 2.9.1 e 2.9.2). Per accelerare il processo, eseguire separatamente gli allineamenti nel piano e fuori dal piano.NOTA: per ogni binning, si consiglia di eseguire più cicli e ridurre gradualmente le impostazioni angolari. Per il set di dati ApoF, sono stati effettuati altri cinque cicli al bin 4 e ulteriori dettagli sono disponibili nella tabella supplementare 2. Per cycle001, nella cartella del progetto, eseguire: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, seguito da emClarity alignRaw param1.m 1. Pulire le particelle sovrapposte. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity removeDuplicates param5.m 5. Esegui il perfezionamento della serie Tilt con tomoCPR.Nota : questo passaggio è facoltativo.Eseguire tomoCPR per perfezionare la geometria dello stack. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity tomoCPR param5.m 5. Generare nuove pile allineate e aggiornare i file di geometria. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity ctf update param6.m.NOTA: assicurarsi che i nuovi file geometrici (ad esempio, fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) e gli stack appena allineati (ad esempio, aliStacks/TS1_ali2.fixed) siano generati correttamente. Crea nuovi sottotomogrammi in bin2. Nella cartella del progetto, eseguire: emClarity ctf 3d param6.m.NOTA: Questo sarà seguito da alcuni cicli per la media e l’allineamento al bin2 (passaggi 2.9.1, 2.9.2 e 2.9.3), la pulizia duplicata (passaggio 2.9.4) e tomoCPR opzionale (passaggio 2.10). A causa dell’elevata simmetria, sono stati effettuati altri cinque cicli a bin2 per l’apoferritina. Aggiornare i parametri Raw_angleSearch per ogni ciclo. Eseguire la ricostruzione finale.Continuare a eseguire alcuni cicli su bin1 e tomoCPR (Passo 2.9 e Passo 2.10). Altri 10 cicli in bin1 sono stati effettuati per il set di dati di apoferritina. Maggiori dettagli sui comandi e sui parametri sono disponibili nella Tabella 2. Eseguire la ricostruzione finale combinando i due set di dati a metà. Nella cartella del progetto, esegui: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, seguito da emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.NOTA: verrà generata la mappa finale (ad esempio, con un fattore B pari a 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc), Figura 11.

Representative Results

Per i campioni cellulari e lamelle, la strategia di raccolta dei dati dipende in gran parte dal campione e dall’obiettivo dello studio di imaging (Figura 1). L’approccio mirato dipende dal fatto che il bersaglio molecolare sia in situ o preparato dal complesso macromolecolare purificato per campioni di ricostruzione ad alta risoluzione contenenti bersagli molecolari. Per i complessi purificati vetrificati su griglie di holey (carbonio), il targeting può essere semplicemente basato sull’imaging nei fori del film di supporto (carbonio). Per il lavoro in situ , l’approccio di targeting richiede la conoscenza della posizione dell’entità molecolare sulla base di dati correlati o punti di riferimento cellulari noti a basso ingrandimento. I punti di riferimento cellulari sarebbero idealmente identificabili quando si scattano immagini panoramiche e, se sufficienti a localizzare approssimativamente le regioni di interesse, possono fornire un modo rapido per confermare l’identità di destinazione con un’immagine di ricerca. Tuttavia, se gli eventi osservabili sono rari, potrebbero essere necessarie immagini di ricerca a medio ingrandimento per qualificare il target corretto. Le mappe di ricerca sono montaggi di ingrandimento medio delle immagini di ricerca e possono, quindi, rendere molto più facile la ricerca del bersaglio, dove possono essere acquisite a un ingrandimento in cui è visibile la caratteristica di interesse. Le mappe di ricerca possono quindi essere sottoposte a screening per trovare e impostare le posizioni batch di destinazione. Per i campioni contenenti caratteristiche cellulari per la ricostruzione ultrastrutturale, l’approccio di targeting è simile, sebbene ugualmente dipendente dalla visibilità dell’evento cellulare a vari ingrandimenti e dalla sua prevalenza nel campione. Anche la strategia di acquisizione dei dati deve essere considerata; In tutti i casi, l’obiettivo dello studio determina in gran parte il modo in cui i dati vengono raccolti. Per la ricostruzione dell’ultrastruttura cellulare, un basso ingrandimento (20-5 Å/px) e un ampio campo visivo possono essere appropriati, ma sono necessari ingrandimenti elevati per ricostruire dettagli molecolari o ad alta risoluzione (5-1 Å/px). Un set di dati raccolto a 1,5 Å/px in condizioni ideali sarà fisicamente in grado di produrre solo una ricostruzione alla frequenza di Nyquist di 3,0 Å/px; Tuttavia, in realtà, molti fattori, inclusi ma non limitati allo spessore, alle dimensioni e all’eterogeneità del campione, influenzano tutti la qualità della ricostruzione ottenuta. I parametri di imaging esatti bilanciano anche l’ingrandimento in base all’obiettivo dello studio con il campo visivo per contenere informazioni sufficienti. Questo articolo presenta un caso medio di sottotomogramma che raggiunge 2,86 Å, ma ulteriori studi 17,42,43,44,45 sono presentati nella Tabella 1 per illustrare i parametri di raccolta associati agli studi mirati a risultati diversi17,42,45,46. Una volta stabilito un flusso di lavoro di targeting e un regime di acquisizione dati per crio-ET, è possibile la raccolta di dati di molti tipi di campioni diversi. I tomogrammi rappresentativi di una varietà di campioni sono presentati qui: campioni molecolari come l’apoferritina (Movie 1), i processi cellulari sottili (Movie 2) e la lamella fresata FIB del campione cellulare spesso (Movie 3). Figura 1: Panoramica dell’impostazione del flusso di lavoro della tomografia. Il flusso di lavoro di imaging cryo-ET descritto nel protocollo viene mostrato come diagramma di flusso. Le immagini che ci si aspetta di acquisire sono mostrate per il flusso di lavoro cellulare e molecolare. La denominazione presentata segue la convenzione Tomo5, sebbene la maggior parte dei software di acquisizione della tomografia condivida principi comuni per la raccolta di queste immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Scheda Preparazione e condizioni preimpostate di ricerca . (A) Immagine panoramica dell’intera scheda. I predefiniti delle condizioni di imaging sono impostati in questa scheda e “Calibra spostamento immagine” e “Impostazioni filtro immagine” sono disponibili nel menu a discesa “Attività”. (B) Zoom avanti del menu a discesa “Preset” in cui ogni preset può essere selezionato per l’impostazione delle singole condizioni di imaging. (C) Immagine raffigurante un ingrandimento adeguato per adattare sia l’esposizione che l’area “Focus and Tracking” nel campo visivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Calcolo della dose. Esempi di calcoli di dose per possibili schemi di acquisizione di tomogrammi in cui l’intensità di dose è stata misurata sotto vuoto. I due calcoli determinano il tempo o i tempi di esposizione per ciascuna inclinazione, sia che si tratti di una dose ottimale per inclinazione o di una dose totale ottimale per la serie completa di inclinazione. Nella media dei sottotomogrammi, è pratica comune mirare a una dose ottimale per immagine inclinata nell’intervallo 3,0-3,5 e-/Å2. In entrambi i casi, le “Frazioni (Nr.)” sono impostate su 6 per ottenere ~ 0,5 e-/Å2 di dose per fotogramma filmato dell’inclinazione per un segnale sufficiente per eseguire la correzione del movimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: scheda Atlante. Immagine panoramica della scheda “Atlante”. L’immagine è stata ritagliata per evitare spazi vuoti nella posizione della griglia. Il menu “Attività” contiene le preferenze di impostazione della sessione e gli spazi di selezione della griglia per la selezione individuale di tutte le griglie inventariate e un’opzione per acquisire un singolo atlante dopo che la cassetta è stata rimossa dal caricatore automatico. Una griglia selezionata può essere reimpostata e quindi riacquisita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Spostamenti calibrati dell’immagine. L’immagine raffigura un’immagine di esposizione e ricerca. La croce rossa nell’immagine di ricerca è l’indicatore spostato per correggere l’offset tra esposizione e ricerca. Si dovrebbero ripetere le calibrazioni dello spostamento dell’immagine all’inizio della sessione o dopo aver modificato i preset delle condizioni di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 6: Funzioni automatiche e diaframmi. (A) La scheda “Funzioni automatiche” mostra il menu a discesa “Predefiniti” e la selezione “Attività”. Sottolineato in blu è il preset “Thon Ring” richiesto per “Autostigmate” (sottolineato anche in blu) e “Autocoma”. È necessario selezionare i rispettivi preset per ogni attività e quindi premere il pulsante Start. (B) Le aperture si trovano nell’interfaccia utente TEM. Selezionare “Apertura obiettivo” desiderata dopo che le funzioni automatiche sono state eseguite ed eseguire “Autostigmate” con l’apertura in. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Panoramica della scheda Tomografia. Le immagini mostrano l’interfaccia utente di Tomo 5.8. (A) Posizioni dei lotti. Le ultime funzioni raffigurate nell’immagine: l’opzione “Acquisisci mappa di ricerca”; Le posizioni dei tomogrammi vengono visualizzate nella vista Atlante con l’opzione di zoom; evidenziato in alto a destra è “Seleziona posizioni”; di seguito sono state selezionate tutte e quattro le posizioni per i parametri “Aggiorna defocus”. (B) Sulla mappa di ricerca sono selezionate tre posizioni, etichettate 1, 2 e 3. La posizione 1 non rappresenta un problema quando viene eseguito “Perfeziona tutto”. Tuttavia, se in un’impostazione ad alta densità del bersaglio, come quando vengono selezionate le posizioni delle lamelle, come illustrato per la posizione 2 e la posizione 3, “Perfeziona tutto” eseguirà la routine “Tracking” e “Focus” sulla regione “Esposizione” della posizione 2, esponendo il target prima che il tomogramma venga acquisito. Il tipo di griglia è R1.2/1.3. Barra di scala = 1,2 μm. (C) Acquisizione dati. Le posizioni selezionate impostate in “Posizioni batch” possono ora essere acquisite individualmente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 8: Definizione dell’angolo di inclinazione massimo. La figura illustra un approccio passo-passo per determinare l’intervallo di inclinazione massimo per le acquisizioni di tomogrammi. (A) Panoramica 0° e una mappa di ricerca al centro del quadrato della griglia. Per testare l’intervallo di inclinazione, l’angolo può essere impostato nel software di tomografia con “Set Tilt (°)” digitando il valore desiderato e quindi premendo Set. (B) Il palco è stato inclinato a -60°, mostrando che un angolo della mappa di ricerca non sarebbe completamente acquisito a -60°. (C) Il palco è stato inclinato di 60°. Contando i fori che sono scomparsi a ±60°, si può avere un’idea del campo di inclinazione di un quadrato della griglia. Barre di scala = 2,5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 9: diagramma di flusso emClarity. Il diagramma di flusso descriveva le varie fasi per la media del subtomogramma criogenico. Barre della scala = 50 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 10: Corrispondenza del modello utilizzando emClarity . (A) Una tipica micrografia di apoferritina su una griglia rivestita di grafene. Sfocatura: −3,430 μm. (B) Una fetta del tomogramma sovrapposta ai punti del modello dopo la ricerca del modello. (C) Una vista superiore e (D) una vista di proiezione laterale dei punti del modello, che indica un singolo strato piatto di particelle di apoferritina monodisperse. Barre della scala = 50 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 11: Cryo-ET STA dell’apoferritina . (A) La mappa finale dopo 21 cicli di allineamento del sub-tomogramma. (B) Il grafico di correlazione della shell di Fourier (FSC) della mappa finale con una risoluzione riportata di 2,86 Å, contenente 38 FSC a cono. (C) Mappe di densità rappresentative (equipaggiate con modello PDB 6s6147). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Campione Tipo Cryo-ET Å/px Intervallo di inclinazione (+/-) Passo di inclinazione (°) Intervallo di sfocatura (μm) Dose totale (e-/Å2) Risoluzione Dati grezzi Riferimento Apoferritina Purificato/molecolare (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 EMPIAR-10787 17 & questo documento HIV-1 Gag Purificato/molecolare (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17 Ribosoma Purificato/molecolare (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 EMPIAR-10304 42 Picco SARS-CoV-2 Lamella/Molecolare (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 EMPIAR-10753 45 Struttura dell’assone del neurone Cellulare (ultrastrutturale) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 N.D. EMPIAR-10922 47 Tabella 1: Parametri di raccolta per diversi studi crio-ET. Studi mirati alla ricostruzione di dettagli molecolari da proteine purificate o in situ rispetto a uno studio che mira a risolvere e segmentare le caratteristiche cellulari ultrastrutturali. Filmato 1: Un tomogramma di campioni di apoferritina su una normale griglia EM e poi ripresi con un crio-TEM dotato di una telecamera ad altissima risoluzione con un filtro compatibile. Le serie Tilt sono state acquisite con uno schema simmetrico di dose, con un intervallo di inclinazione di 54° e una dose totale di 134 e-/A2 nel software di tomografia elettronica. Barra di scala = 50 nm. Clicca qui per scaricare questo film. Filmato 2: Un tomogramma di un neurone primario cresciuto su una griglia EM e poi ripreso direttamente con un crio-TEM dotato di una telecamera ad altissima risoluzione con un filtro compatibile. Le serie tilt sono state acquisite con uno schema simmetrico di dose, con un intervallo di inclinazione di 60° e una dose totale di 120 e-/A2 nel software di tomografia elettronica. Barra di scala = 100 nm. Clicca qui per scaricare questo film. Filmato 3: Un tomogramma di un cianobatterio su una griglia EM, sottoposto a fresatura FIB e quindi ripreso con un crio-TEM dotato di una telecamera ad alta velocità e di un filtro compatibile. Le serie di inclinazione sono state acquisite con uno schema simmetrico di dose, con un intervallo di inclinazione di 50° e una dose totale di 120 e-/A2 nel software di tomografia elettronica. Barra della scala = 87,2 nm. Clicca qui per scaricare questo film. File supplementare 1: il modello di file di parametri per la stima della sfocatura. Clicca qui per scaricare questo file. Tabella supplementare 1: Raccolta dei dati e dettagli di configurazione del microscopio. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella supplementare 2: Elenco dei comandi in ordine di esecuzione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Tomo5
La descrizione del flusso di lavoro del software di tomografia evidenzia un modo potenziale e più semplificato per una configurazione della sessione di tomografia batch (remota). Mentre il software è facile per i principianti, una certa esperienza iniziale di crio-EM e la comprensione della tomografia di base possono aiutare con la configurazione. I passaggi critici sono evidenziati nel protocollo e dovrebbero aiutare a risolvere i problemi anche se è stato utilizzato un approccio di installazione diverso. L’avanzamento del software faciliterà la raccolta dei dati (remoti) e renderà la crio-ET più accessibile a un’ampia base di utenti. Di seguito sono descritti alcuni suggerimenti e trucchi che possono aiutare a risolvere i problemi più frequenti.

Un punto importante da discutere è la scelta delle griglie perché, quando si inclina il campione a ±60°, le barre della griglia ad inclinazioni elevate possono oscurare la vista (Figura 8). Su una griglia TEM, la dimensione della maglia si riferisce al numero di quadrati della griglia per unità di lunghezza della griglia. I numeri di mesh più grandi hanno più quadrati della griglia per lunghezza unitaria, una maggiore densità di quadrati della griglia e quadrati della griglia più piccoli, cioè una griglia a 400 maglie ha quadrati più piccoli di una griglia a 200 maglie. Una buona scelta di griglie per la tomografia è griglie a 200 o 300 maglie. Come mostrato nella Figura 8, l’area disponibile per raccogliere si riduce quando la griglia viene inclinata. Con un’inclinazione di ±60°, una griglia a 300 maglie avrà un piccolo campo visivo su cui è possibile acquisire un tomogramma completo. I vantaggi delle griglie a 200 maglie sono che i quadrati della griglia più grandi rendono più veloce la configurazione della tomografia molecolare e, con l’aumento dell’area del quadrato della griglia, un quadrato sarà probabilmente sufficiente per una raccolta notturna. Lo svantaggio è che le griglie a 200 maglie sono più fragili, quindi la manipolazione e il taglio richiedono più finezza.

Inoltre, se si utilizza una pellicola di supporto holey (vedi Tabella dei materiali) su griglie EM, la spaziatura dei fori deve essere considerata per l’impostazione della regione di messa a fuoco e di tracciamento in relazione alla regione di esposizione. Idealmente, il diametro del fascio all’ingrandimento desiderato dovrebbe essere abbastanza piccolo da coprire l’area di carbonio adiacente all’area di esposizione lungo l’asse di inclinazione per una configurazione ottimale e veloce. In questo modo, è possibile acquisire potenziali regioni di interesse in ciascun foro.

Poiché la routine di altezza eucentrica del software non è attualmente così robusta, come la routine serialEM, i seguenti suggerimenti possono aggirare il problema. Se la determinazione dell’altezza eucentrica fallisce utilizzando il preset di altezza eucentrica, è possibile utilizzare invece il preset di panoramica ed eseguire nuovamente “Auto-eucentrico per inclinazione dello stadio”; Questo può risolvere i problemi se l’altezza eucentrica è lontana da 0. Se ciò riesce, è possibile eseguire nuovamente “Auto-eucentric by stage tilt” con i preset “Eucentric Height” per migliorare la precisione. Se fallisce, è possibile eseguire “Auto-Eucentric by beam tilt” con il preset eucentric height e quindi ri-eseguire “Auto-Eucentric by stage tilt” o impostare manualmente l’altezza z consolidata da “Auto-Eucentric by beam tilt” nell’interfaccia utente TEM sotto le impostazioni “Stage”. Nel caso in cui vengano utilizzate griglie con uno schema ripetuto di fori, possono impedire l’identificazione di un singolo picco di correlazione incrociata. Si può provare a modificare l’altezza eucentrica preimpostata con un offset di sfocatura inferiore come -25 μm e / o un tempo di esposizione più breve per ridurre la correlazione incrociata dai modelli di foro. D’altra parte, l’uso di griglie / lamelle lacey potrebbe non fornire un segnale sufficiente per un forte picco di correlazione incrociata. Si può provare a modificare l’altezza eucentrica preimpostata con un maggiore offset di sfocatura come -75 μm e / o un tempo di esposizione esteso per migliorare il picco di correlazione incrociata. Un’altra opzione è regolare le impostazioni del filtro immagine; possono essere trovati nella scheda “Preparazione”. Le opzioni per regolare le impostazioni del filtro possono essere impostate per ingrandimento basso (Panoramica / Gridsquare), medio (altezza eucentrica) e alto (Tracking / Focus) per trovare il picco di correlazione incrociata ottimale per ciascun preset. L’input richiesto è un’immagine, cioè a 0° e una a 5°, seguita da Confronta per confrontare entrambe le immagini. Il valore iniziale consigliato per la lunghezza d’onda più lunga è un quarto della barra della scala nell’immagine e per la lunghezza d’onda più corta è un quarantesimo della barra della scala. Se il picco non è identificato in modo robusto, è possibile ottimizzare le impostazioni fino a quando non si trova un picco convincente. Non è necessario riacquisire immagini ogni volta; basta premere “Confronta”. Se TOMO non riesce ancora a trovare automaticamente l’altezza eucentrica, è possibile utilizzare la calibrazione manuale dell’altezza eucentrica. Si dovrebbe centrare su un cristallo di ghiaccio ragionevolmente grande nell’ingrandimento generale nella scheda “Preparazione”, quindi andare al “Controllo scenico” dell’interfaccia utente TEM, impostare alfa a -30 ° e regolare il valore z dello stadio per ricentrare il cristallo usando l’immagine dello schermo fluorescente. La selezione delle impostazioni “Alta risoluzione” e “Contrasto elevato” nell’interfaccia utente TEM renderà questo semplice (pulsanti nella parte inferiore della finestra dello schermo fluorescente). Opzionalmente, se c’è accesso a una telecamera con modalità live, questo può essere utilizzato per determinare l’altezza eucentrica; Sarà più facile che sullo schermo fluorescente.

Le maggiori limitazioni nelle versioni Tomo5 precedenti alla 5.8 sono i montaggi di ingrandimento medio mancanti, lo schema simmetrico della dose mancante e i problemi relativi alla ricerca dell’altezza eucentrica. Questi esistono in serialEM, un freeware con rapido sviluppo e supporto della comunità, una robusta routine di altezza eucentrica e l’opzione di script, cioè uno schema simmetrico di dose personalizzato. Dalla versione 5.8 in poi in Tomo5, il problema più comunemente riscontrato per trovare l’altezza eucentrica, cioè un looping non riuscito attorno al valore z target, è stato risolto implementando l’opzione di impostare un criterio di accettazione dell’altezza eucentrica. Tuttavia, con diversi tipi di griglia e campione, si consiglia vivamente di regolare le impostazioni del filtro immagine per riflettere le condizioni di imaging uniche delle singole sessioni e per fornire il miglior picco di correlazione incrociata possibile per trovare l’altezza eucentrica e per far funzionare in modo affidabile la regione di messa a fuoco e di tracciamento durante l’acquisizione del tomogramma.

Nel complesso, molte strutture si sono rapidamente adattate al funzionamento remoto durante la pandemia. Il software Tomo5 fornisce un facile accesso e un percorso intuitivo alla tomografia che è adatto per il funzionamento remoto. I progressi compiuti nel software continueranno senza dubbio a rendere le raccolte di dati remoti e la raccolta di tomografie in generale più mainstream nella comunità.

emChiarezza
Poiché emClarity utilizza un metodo di prelievo delle particelle basato su modelli, ha bisogno di un modello per l’oggetto di interesse. La raccolta delle particelle (fase 2.6) è molto sensibile e fondamentale per la struttura finale. Prima di calcolare la media e l’allineamento (passaggio 2.9), è necessario assicurarsi di controllare attentamente e rimuovere manualmente i falsi positivi. Quando un modello non è disponibile, emClarity potrebbe non essere facile da usare, ma è possibile utilizzare altri software, ad esempio Dynamo37 e PEET48, per creare un modello iniziale.

Per campioni eterogenei, emClarity è dotato di un metodo di classificazione che consente agli utenti di concentrarsi su caratteristiche specifiche con scale diverse. È utile eseguire alcuni cicli di allineamenti prima della classificazione ed eseguirli a un binning più alto (ad esempio bin 4 o bin 3).

La versione aggiornata del software (V1.5.3.11) presenta aggiornamenti significativi rispetto alla prima versione (V1.0)17. Questi includono, ma non sono limitati a, un controllo della mano durante la stima della CTF (fase 2.3); simmetria per allineamenti (CX, I, I2, O); calcolo delle funzioni di campionamento 3D per particella (3DSF); un passaggio a MATLAB 2019a per compatibilità e stabilità; e ricostruzione utilizzando le immagini di proiezione grezze (cisTEM). Il software continuerà a migliorare per vari campioni e gli annunci più recenti possono essere trovati online (vedi Tabella dei materiali).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo Diamond Light Source per l’accesso e il supporto delle strutture crio-EM presso l’Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) del Regno Unito, finanziato da Wellcome Trust, MRC e BBRSC. Vorremmo anche ringraziare Andrew Howe per l’acquisizione del tomogramma Apoferritina (Movie 1), Ishika Kumar per la preparazione e l’acquisizione del tomogramma neuronale (Movie 2) e Craig MacGregor-Chatwin per il tomogramma lamella-cianobacteria (Movie 3).

Materials

Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG – Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil – A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan –
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific –
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ – – Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ – – Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial – – Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software – – Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki – – Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity
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References

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Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).
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