JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63923
, , ,
1Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics,University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute,University of Oxford

Summary

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Abstract

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), özellikle doğrudan elektron dedektörlerinin piyasaya sürülmesinden, geliştirilmiş otomatik edinme stratejilerinden, elektron mikroskobunun kriyo-ET ve yeni subtomogram ortalama yazılımı kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüleyebileceği olasılıkları genişleten hazırlık tekniklerinden bu yana son yıllarda ivme kazanmaktadır. Ek olarak, veri toplama giderek daha akıcı hale geldi ve birçok kullanıcı için daha erişilebilir hale geldi. SARS-CoV-2 pandemisi, özellikle tek parçacıklı kriyo-EM için küresel olarak birçok tesiste uzaktan kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) veri toplamayı daha da hızlandırdı ve pandemi sırasında son teknoloji cihazlara kesintisiz kullanıcı erişimi sağladı. Tomo5’teki (3D elektron tomografisi yazılımı) son gelişmelerle birlikte, uzaktan kriyo-ET veri toplama sağlam ve dünyanın her yerinden kullanımı kolay hale gelmiştir. Bu makale, tomografi yazılımındaki veri toplama kurulumundan başlayarak, ayrıntılı sorun giderme ile (uzak) bir kriyo-ET veri toplama oturumunun işlenmesi için ayrıntılı bir yol izlemeyi amaçlamaktadır. (Uzak) veri toplama protokolü, örnek olarak apoferritin kullanılarak, emClarity ile ortalama subtomogram ile atoma yakın çözünürlükte yapı belirleme iş akışı ile tamamlanmaktadır.

Introduction

Kriyojenik elektron mikroskobunun (kriyo-EM) bir rönesans dönemi yaşadığı ve yapısal biyolojide temel ve merkezi olarak yararlı bir araç haline gelmesini hızlandırdığı yaygın olarak bilinmektedir. Doğrudan elektron dedektörlerinin geliştirilmesi ve kullanımı 1,2,3, geliştirilmiş mikroskoplar ve elektron kaynakları 3,4,5, otomasyon/verim 6,7,8,9 ve tek parçacık analizinde hesaplamalı ilerlemeler 10,11,12,13 ,14 ve tomografi15,16,17, kısmen, tekniğin son başarısından sorumludur. Bu teknolojik sürücüler, kriyo-EM’nin biyolojik makromoleküler yapıları kriyojenik ve doğal koşullar altında çözme yeteneğini geliştirmiştir. Kolayca elde edilebilen çözünürlükler, atomik olarak doğru modelleme için yeterlidir ve tekniği yapısal biyoloji arenasında ön plana çıkarmıştır. İlgilenilen biyolojik bir hedefi ifade etmek ve arındırmak için indirgemeci bir yaklaşım, temel biyolojik araştırmalar, ilaç keşfi ve translasyonel bilim için makromoleküler kristalografide (MX) uzun zamandır başarılı olduğunu kanıtlamıştır. Aynı yaklaşımda, kriyo-EM artık yüksek çözünürlüklü MX çalışmalarına paralel sonuçlar verebilir. Yapısal biyolojinin kriyo-EM dalındaki mevcut büyük başarı, biyolojik bir makromolekülün binlerce görünümünü elde etmek için tipik olarak saflaştırılmış bir protein örneği18’in 2D projeksiyon görüntülerini elde eden tek parçacık analizi (SPA) olarak adlandırılır19. Bu görüntüler (1) hedefin 3B uzaydaki yönelimlerini tam olarak temsil eden bir dizi görünümden bilgi içerir ve (2) daha sonra ayrılabilen ve araştırılabilen nesne konformasyonel heterojenliğini yakalar.

Biyolojik örneklerin bu 2D projeksiyon görüntülerini, yerinde ve saflaştırma olmadan bile elde etmek için alternatif bir yaklaşım, kriyo-elektron tomografisidir (kriyo-ET). Cryo-ET, numuneyi mekanik olarak döndürerek aynı nesnenin bir dizi görüntüsünü eğik açılarda çeker. Böylece, SPA’da toplanan ve ilgili molekülün açısal pozlarını temsil eden 2D projeksiyonlar, doğal olarak kriyo-ET görüntüleme deneyi20’nin bir parçası olarak toplanır. Tomografik eğim serileri daha sonra görüntülenen makromoleküler komplekslerin 3D gösterimlerini içeren bir tomograma yeniden yapılandırılır. Tomografik veri toplamanın doğası, bir dereceye kadar, bir molekülün 2D görüntü koleksiyonundan tam bir 3D temsilini elde etmek için ortalamaya olan bağımlılığı azaltır. Bununla birlikte, mevcut aşama tasarımları nedeniyle, numune tipik olarak -60 ° ila +60 ° arasında eğilir ve tomografi 3D rekonstrüksiyonunda eksik bir kama21 bilgi bırakır.

Tek bir tomogramdaki 3D rekonstrüksiyonlar daha sonra eksik bir bilgi dilimine ve gürültüye düşük sinyale sahiptir. Bireysel makromoleküller subtomogramlar olarak ekstrakte edilebilir ve bununla başa çıkmak için birlikte ortalamaları alınabilir. Bir subtomogramdaki her makromolekülün farklı bir yönde bulunduğu yerde, eksik kama hedef nesnenin her bir subtomogramında farklı şekilde yönlendirilir, bu nedenle birçok kopyanın ortalaması eksik kama nedeniyle bilgileri doldurur. Görüntü işlemedeki son gelişmeler, yapay zeka sinir ağlarını eksik takozu anlamlı verilerle doldurmak için eğitmeye çalıştı22. Bu ortalama alma işlemi, tek parçacık analizinde ortalama alma hedefine benzer şekilde, sinyali gürültüye yükseltir, böylece rekonstrüksiyonun kalitesi ve çözünürlüğü artar. Eğer ilgilenilen molekül simetriye sahipse, bu da ortalama alma sırasında tanımlanabilir ve kullanılabilir, böylece rekonstrüksiyon çözünürlüğü daha da iyileştirilebilir. Bir makromolekülün 3D hacimlerinin bir tomogramdan bir dizi subtomograma çıkarılması ve daha sonraki işlemleri subtomogram ortalaması (STA) 23 olarak bilinir. Her subtomogramın incelenen molekülün benzersiz bir kopyasını temsil ettiği durumlarda, STA iş akışı kullanılarak herhangi bir yapısal heterojenlik sorgulanabilir. SPA iş akışında yaygın olarak kullanıldığı gibi, STA sırasında ilgili kompleksin konformasyonel durumlarını incelemek için sınıflandırma teknikleri kullanılabilir. Kriyo-ET’de yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonu sağlayan STA’nın yanı sıra, bu yaklaşım tekniği makromoleküllerin doğal hücresel ortamlarındaki veya genellikle SPA24,25,26’ya uygun olmayan hedeflerin yapısal mekanizmalarını sorgulamak için güçlü bir araç haline getirmektedir.

Elektron tomografisi, oda sıcaklığında hücresel örneklerin 3D ultrayapısını belirleme konusunda uzun bir geçmişe sahiptir27. Numunenin fiziksel olarak eğilmesiyle görünümlerin elde edilmesi, hücresel uzunluktaki ölçeklerde bir nesnenin 3B rekonstrüksiyonu için yeterli bilgi sağlar ve hücresel yapılar ortalama için düzenlilikten yoksun olduğunda özellikle önemlidir. Hücreler ayrıca, numunenin elektron saydam olacak kadar ince olduğu hücre kenarlarında kriyo-ET görüntüleme için substratlar üzerinde dondurulabilir. Bu koşullar altında, STA, numune elektron saydam28 olacak kadar ince olsa da, hücresel bir ortamda makromoleküler yapıları belirlemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kriyo-korelasyonel ışık ve elektron mikroskobu (kriyo-CLEM) ve odaklanmış iyon ışını frezeleme (kriyo-FIB) dahil olmak üzere ek hazırlık teknikleriyle birleştirildiğinde, kriyo-ET, kriyojenik koşullar altında tüm hücrelerin içini görüntülemek için kullanılabilir29. Bu, hücresel ultrayapıyı incelemek için kriyo-ET’nin gücünü, makromoleküler komplekslerin yapılarını in situ olarak belirlemek için STA’nın gücüyle bir araya getirirken, hücresel konumlarını belirlerken30 ve dinamik süreçlerle uğraşan komplekslerin anlık görüntülerini sağlar31. Tekniğin hücresel örnekleri görüntüleme ve çeşitli çalışmalarda STA’yı kullanma yeteneği, tekniğin SPA32 ile karşılaştırılabilir çözünürlüklerde bile makromoleküler yapıları yerinde çözme gücünü vurgulamıştır. Tomogram30’daki son sınıflandırılmış 3D rekonstrüksiyonu ile temsil edilen makromolekülün orijinal konumunun bilinmesinde başka bir fayda da bulunur. Bu nedenle, makromoleküler yapı hücresel ultrayapı ile ilişkilendirilebilir. Uzunluk ölçekleri arasındaki bu gözlemler muhtemelen yapısal mekanizmaların fonksiyonel çalışmalar bağlamında hücresel değişikliklerle ilişkili olabileceği önemli bulgulara yol açacaktır.

Cryo-ET ve STA üç ana iş akışında veri toplamaya izin verir: moleküler, hücresel ve lamel tomografisi. Saflaştırılmış makromoleküler komplekslerin yapıları moleküler tomografi ile kriyo-ET ile belirlenebilir. Hücrenin yeterince ince olduğu hücresel ortamlarında protein yapılarının belirlenmesi hücresel tomografi olarak tanımlanabilir. Daha yakın zamanlarda, kriyojenik hedefleme ve öğütmenin gelişmesiyle birlikte, aynı teknikler, doğal ortamlarında hücrenin derinliklerindeki protein yapılarını belirlemek ve bu proteinlerin gözlemlendiği hücresel bağlamı ortaya çıkarmak için lamel tomografisi iş akışlarında uygulanabilir. Mevcut yazılım paketlerine ve en önemlisi numunenin ihtiyacına bağlı olarak farklı veri toplama stratejileri kullanılabilir. Saflaştırılmış bir proteinin bakır TEM ızgarasındaki moleküler veya yapışkan olmayan numuneler tipik olarak daha az işlem gerektirir ve bu nedenle ideal durumlarda düz ve hasarsız kalır. Elektron tomogramları, sistematik bir şekilde onlarca ila yüzlerce tomogramı hızlı bir şekilde elde etmek için delikli karbon ızgarası boyunca seri olarak kolayca kurulabilir. Kullanıcıların ızgarada proteinlerin bol miktarda bulunduğu moleküler tomografi örneklerini kurmalarının en basit yolu, Tomo5’i kullanmak olacaktır (bu çalışmada kullanılan 3D elektron tomografisi için yazılım, bkz. Leginon9 ve seriEM6 gibi diğer tomografi yazılımları da mevcuttur; veri toplama için daha kişiselleştirilmiş yaklaşımlar için daha fazla kurulum seçeneği sunarlar, ancak daha karmaşıktırlar ve sonuç olarak, özellikle tomografiye yeni başlayan kullanıcılar ve oturumlarına uzaktan erişen kullanıcılar için gezinmek daha zor olabilir. Geniş ve çeşitli kullanıcı tabanına sahip bir tesis için, Tomo5’in uzak bir ortamda çalıştırılması ve kullanıcıları eğitmesi kolaydır. Yapışkan hücreler için, ızgaralar tipik olarak daha fazla taşıma adımı gerektirir ve kırılgan altın ızgaraların kullanılması gerekliliği, işleme ve veri toplama stratejilerinde daha iyi bakım ihtiyacını artırır. İlgilenilen hücresel bir bölgeyi bulmayı kolaylaştırmak ve yüksek eğim açılarında ızgaranın kendisinden tıkanmayı önlemek için, daha büyük ağ boyutları kullanmak da faydalıdır, ancak doğal olarak daha kırılgan olmaları pahasına. Lamel örnekleri için, numunenin kırılganlığı, değişken olabilen lamelin kalitesi ile belirlenir. Bu faktörler kurulum süresini ve dikkat edilmesi gereken noktaları artırır, ancak artan uyarlanabilirlik ve sağlamlık Tomo5’i bu tür veri toplama için uygun hale getirir. Ancak, her iş akışı için özelleştirilmiş veri toplama senaryoları vardır. BISECT ve PACE-tomo (her ikisi de SerialEM’de çalışır), özellikle moleküler tomografide tomogram toplama hızını28 artırmak için tomografi alımı sırasında senaryolu ışın görüntüsü kaydırma olasılığını ortaya koymaktadır. SerialEM 6,7,33’teki orta büyütme montajları (MMM), tüm iş akışlarındaki moleküler özellikleri daha iyi tanımlayabilir ve hassas bir şekilde hedefleyebilir, ancak yazma sırasında bu özellikler Tomo5’te uygulanmaya başlanmıştır.

SPA gibi, cryo-ET ve STA da satın alma yazılımında yapılan iyileştirmeler ve subtomogram için ortalama 16,17,32,34,35,36,37,38 olan çok sayıda mevcut paket sayesinde giderek daha erişilebilir hale geliyor. Buna ek olarak, pandemi sırasında, kriyo-EM enstrümantasyonuna uzaktan erişimin sağlanması, İngiltere’deki Diamond Light Source (DLS) adresindeki elektron Biyo-Görüntüleme Merkezi (eBIC) gibi ulusal tesislerin çalışmaya devam etmesi için gerekli hale geldi. Bu gelişmeler, tekniği kullanmak isteyen araştırmacılar için kriyo-ET’yi daha erişilebilir ve sağlam hale getirmiştir. Veriler elde edildikten sonra, STA, maksimum çözünürlük rekonstrüksiyonu elde etmek ve makromoleküler heterojenliğin sınıflandırılmasına izin vermek için tekrarlayan nesneleri analiz etmek için gerekli bir araçtır. Mevcut protokol, kriyo-ET veri toplama için bir kriyo-TEM mikroskobu hazırlama ve örnek olarak apoferritinin moleküler tomografi veri setinde emClarity kullanarak subtomogram ortalamasının nasıl gerçekleştirileceği hakkında ayrıntılı bir yol izlemeyi amaçlamaktadır. emClarity kullanımı (yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi ve subtomogram ortalaması için yazılım, bkz. Malzeme Tablosu) komut satırından komut dosyalarının çalıştırılmasını gerektirir, bu nedenle Linux / UNIX sistemlerine bir aşinalık düzeyi varsayılır.

Uzak bağlantı, her enstitüdeki/tesisteki ağ ortamına bağlıdır. eBIC’de uzak sistem, Diamond’da kullanılan belirli ağ yapılandırmasında uzaktan veri toplanmasına izin veren programlar kullanır. Mikroskopa uzaktan bağlantı iki platform tarafından kolaylaştırılmıştır: NoMachine ve TeamViewer (bkz. NoMachine programını kullanarak, kullanıcı uzak bir Windows masaüstünde oturum açabilir. NoMachine tarafından sağlanan uzak Windows masaüstü, mikroskopla aynı ağda bulunur ve bu nedenle mikroskop için sanal bir destek bilgisayarı görevi görür. Sanal destek bilgisayarından kullanıcı, TUI ve Tomo çalıştıran mikroskop PC’ye doğrudan erişim ve kontrol sağlayan TeamViewer aracılığıyla mikroskopa bağlanır.

Mevcut protokol iki bölümden oluşmaktadır (adım 1 ve adım 2). Adım 1, Tomo5 (3D elektron tomografisi için yazılım) kullanılarak uzaktan kriyo-ET veri toplamaya odaklanmaktadır. (Uzak) bir oturumun izlenecek yolu, kullanıcının tomografi yazılımını tomografi verilerini toplamak için numune alanlarını hedeflemeye yönlendirmesine izin vermek için görüntüleri giderek daha yüksek büyütmelerde yakalar. Şekil 1 bu süreci özetlemektedir. Adım 2, emClarity (yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi ve subtomogram ortalaması için yazılım) kullanılarak kriyo-ET STA veri işlemeyi detaylandırır. Şekil 9 bu süreci özetlemektedir.

Protokol uzak bir kitleye yöneliktir. Kişinin fiziksel olarak mikroskopta olduğunu ve numunelerin yüklenmesinin doğrudan hizalamaları yaptığını ve kamera ayarlaması ile ilgilendiğini ve referans edinimi sağladığını varsayar. Bu protokol için, otomatik yükleyicili üç kondansatörlü bir lens sistemi varsayılmaktadır. Tomografi yazılımı hakkında daha ayrıntılı yönergeler için, yazılımın yüklendiği Windows Başlat düğmesinde üretici tarafından ayrıntılı bir el kitabı mevcuttur.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan yazılım paketleri kısmen ücretsiz olarak temin edilebilir (bakınız Malzeme Tablosu). 1. Tomo5 kullanarak uzaktan kriyo-ET veri toplama Yazılım yüklü değilse, bu yazılımı TEM sunucu bilgisayarından başlatarak başlayın (bkz. İlk kontrolleri gerçekleştirin ve Ön Ayarlar’ı seçerek görüntüleme koşulunu yapılandırın.Hazır Ayarlar altındaki “Hazırlık” sekmesindeki görüntü alma parametrelerini ayarlayarak oturum kurulumunu başlatın (Şekil 2A,B).Yeterli sayım elde etmek için “Genel Bakış büyütmesini” ızgara kare boyutuna ve dozuna uyacak şekilde ayarlayın.NOT: Izgara türü için uygun büyütme bilinmiyorsa, ızgara yükledikten sonra bu adıma geri dönün. “Ösentrik Yükseklik” ve “Arama Büyütme” aynı olabilir. Pozisyonları ayarlamak ve büyütmenin ilgi çekici özelliği göstermek ve görüş alanındaki “Pozlama” ve “İzleme / Odak” alanına sığdırmak için yeterli olduğundan emin olmak için “Tomografi” sekmesindeki Ara’ya tıklayın (Şekil 2C). “Pozlama Büyütme” yi istenen hedef piksel boyutuna ayarlayın. Bu bilinmiyorsa, büyütmeyi ilgilenilen bölgeye uyacak şekilde istenen görüş alanına ayarlayarak oluşturun. Görüntü alma parametrelerini (Pozlama) diğer tüm yüksek büyütmeli hazır ayarlara (İzleme, Sürüklenme, Odak, Thon Halkası, Sıfır Kayıp,) kopyalayın. Bunu yapmak için, mikroskopa “Pozlama” yı ayarlamak için Ayarla’ya basın ve ayrı ayrı seçtikten sonra “Pozlama Ayarları” nı diğer tüm yüksek büyütmelere almak için Alın .Pozlama sürelerini, özellikle “Odak” ve “İzleme” için, uygun sayıda sayım vermek için, ayrıca 60 °’deki kalınlığı da göz önünde bulundurarak, hem 0 ° hem de 60 ° ‘de, çapraz korelasyon için güçlü bir sinyal sağlamak üzere numuneden geçecek yeterli elektron için ayarlayın.NOT: Tahmin olarak, “Pozlama” ön ayarına eşit “İzleme” ve “Odak” için pozlama süreleri iyi bir ilk ölçümdür. “Maruz kalma” ön ayarına ilişkin bir doz hesaplama örneği için bkz: Şekil 3. “Hazırlık” sekmesindeki “Pozlama” ön ayarı için hesaplanan pozlama süresini ayarlayın. “Sıfır Kayıp Ön Ayarı”nı daha parlak ve daha büyük bir spot boyutu (daha büyük bir spot boyutu daha küçük bir sayıya karşılık gelir) kullanacak şekilde ayarlayın, çünkü bu daha yüksek bir doza ihtiyaç duyar.NOT: Bu ön ayar, mikroskopta varsa enerji filtresinin yarığını hizalamak için en iyi şekilde kullanılır. Aşağıdaki adımları izleyerek atlas koleksiyonunu gerçekleştirin.Bir atlas toplamak için, ” Atlas” sekmesinde Yeni Oturum’a tıklayın, oturum tercihlerini ayarlayın, depolama yolunu ve çıktı biçimini girin ve Uygula’ya basın. Tarama’yı seçin (Şekil 4) ve ardından alınacak tüm atlasları işaretleyin. Mikroskopu denetimsiz bırakmak için Kol Vanalarını Kapat’ı seçin; bu, seçilen tüm atlaslar toplandıktan sonra sütun valflerini kapatacaktır. Gösterimi başlatmak için Başlat düğmesine basın. Sol paneldeki “Tarama” (Şekil 4) altındaki Izgara’ya tıklayarak hedefler için tek veya birden fazla atlası inceleyin, ardından hareket etmek için fareyi sol tıklayıp sürükleyin ve yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için orta kaydırmayı yapın. Hedef kurulum için ızgarayı seçin, seçin ve yazılımın içinden Örneği Yükle’ye tıklayın. Görüntü kaydırma kalibrasyonları için, yüklü ızgara içinde gezinmek üzere atlas tarama sekmesini kullanmaya devam edin. Tüm büyütme ön ayarlarında tanınabilecek tanımlanabilir bir özellik, yani bir deliğin kenarı veya başka bir tanınabilir özellik ile örtüşen bir buz kristali bulun (Şekil 5). Fareyi sağ tıklatarak o kareye gidin ve ardından “Sahne alanını Izgara Kareye Taşı”.NOT: Görüntü kaydırma kalibrasyonlarını doğru bir şekilde uygulamak için sahnenin ösentrik yükseklikte olması gerekir. Görüntü kaydırma kalibrasyonu gerçekleştirin.”Otomatik İşlevler” sekmesinde (Şekil 6), ön ayarı “Ösantrik Yükseklik” olarak ayarlayın, “Sahne Alanı Eğmesine Göre Otomatik Ömerkezli” seçeneğine gidin ve Başlat’a basın. Ösentrik yüksekliği bulmanın başarılı olduğundan emin olmak için durum penceresini izleyin ve pozitif ve negatif eğimli görüntülere dikkat edin; korelasyon göstermeleri gerekir.NOT: Tomo yazılımının 5.8 sürümünden itibaren, ösentrik yükseklik kabulü kriteri değiştirilebilir; varsayılan değer 0,25 μm’dir ve 0,5-0,8 μm’ye ayarlanması daha fazla hareket alanı sağlar. Değerler mikroskop performansına bağlıdır, ancak mümkün olduğunca küçük olmaları önerilir.Ösentrik yükseklikte ve odaktayken, sahneyi bir özellik üzerinde ortalayın. “Atlas” hazır ayarını kullanarak bir önizleme toplayın. “Hazırlık” sekmesinden tüm “Ön Ayarlar” ı ayarlayın. Daha sonra, büyütmeyi Genel Bakış > merkezi özelliği > Önizleme’ye yükseltin, ardından “Arama Büyütme” ve son olarak “Pozlama Büyütme” yi tekrarlayın. Hedefleme sırasında özellik ortalanmış olarak kalırsa görüntü kaydırma kalibrasyonlarını atlayın. Aksi takdirde, görüntü kaydırmayı kalibre etmek için “Hazırlık” sekmesine gidin, Görüntü Kaydırmayı Kalibre Et’i seçin ve Başlat’a basın (Şekil 5). Bu, düşük büyütmeleri yinelemeli olarak pozlama büyütme merkezli özelliğe hizalar.NOT: İlk ön ayar “Pozlama” bu aşamada ortalanmazsa, yeniden merkezleme için yazılım yalnızca bu adım için sahne alanı kaydırma kullanır.” Pozlama ” ön ayarı için İlerle’ye basın. Gösterilen bir sonraki resim “Arama ön ayarı” olacaktır. Ön ayarlar arasındaki görüntü geçişini kalibre etmek için, “Ara” önizlemesinde “Pozlama” önizlemesinin merkezinin bulunduğu yere çift sol tıklayın, ardından Yeniden Al (Şekil 5) düğmesine basın. Sonraki ön ayar çiftine geçmek için İlerle’ye tıklayın.NOT: Bu kalibrasyon sırasında atlas büyütmede bir görüntü kaydırma uygulandıysa, görüntü kaydırma kalibrasyonu tamamlandıktan sonra atlası yeniden aldığınızdan emin olun. İstediğiniz atlayı seçin ve “Atlas” sekmesindeki üst panelde Reset Selected (Seçileni Sıfırla ) düğmesine basın. Onaylayın ve atlası tekrar edinmeye başlayın. Tomografi kurulumunu gerçekleştirin.Tomografi veri toplama kurulumunu “Tomografi” sekmesinde oluşturun.NOT: Özel olarak belirtilmediği sürece, kurulum tamamen “Tomografi” sekmesinde yapılır. Yeni bir oturum başlatın. Biyolojik örnekler için “Oturum Kurulumu”nda, numune türü olarak Levha benzeri’ni seçin ve Toplu ve Düşük Doz’u seçin, çıktı biçimini ve depolama klasörünü seçin, isteğe bağlı olarak bir e-posta alıcısı ekleyin ve ardından Uygula’ya basın. NOT: Bir “Toplu İş Pozisyonları” menü öğesi artık kullanılabilir hale gelir (Şekil 7A). Şu anda yüklü olan atlas otomatik olarak içe aktarılır. “Genel Bakış” ve “Arama görselleri”, yeni bir resim edinilene kadar edinilebilir ve tekrar ziyaret edilebilir. Ek olarak, sürüm 5.8’den itibaren, hedef bulma ve kurulumu kolaylaştırmak için “Arama Haritasını Edin” ile 3 x 3, 4 x 4 ve 5 x 5 karoluk arama haritaları edinilebilir. Orta büyütme montajlarının bir versiyonuna karşılık gelirler. Hedefleri ayarlamak için “Atlas okuna” gidin, ilgi çekici bir bölge bulun ve sağ fare tıklamasıyla açılan seçenekleri belirleyerek oraya gidin. Ösantrik yükseklik ayarı için iyi bir konumu onaylamak üzere bir genel bakış görüntüsü alın, ardından Otomatik Ösantrik üzerine basın; bu, ösentrik aşama eğim rutinini çalıştıracaktır. Ardından, ösentrik yüksekliği güncelleştirmek için yeni bir genel bakış görüntüsünü yeniden edinin.NOT: Konum ösentrik yükseklikteyse “Otomatik Netleme” düğmesi gerekli olmamalıdır. Ösentrik yükseklik görüntüsü odak dışında görünüyorsa, ösentrik yükseklik muhtemelen doğru değildir ve yeniden yapılması gerekir (ösentrik yükseklik sorun giderme için tartışma bölümüne bakın). İlk konumu ayarlamadan önce “Genel Bakış” ön ayarını kullanarak hedefi kontrol edin; “Genel Bakış” ön ayarını seçin ve konumların ızgara çubuklarından hangi mesafenin ayarlanabileceğini kontrol etmek için sahne alanını ±60° ‘ye eğin (Şekil 8). Bunu, istediğiniz eğim açısı değerini “Eğimi Ayarla” penceresine girerek gerçekleştirin (Şekil 8A). “Genel Bakış” karesini veya edinilen “Arama Haritası”nı inceleyin, ilgilendiğiniz bir bölgeye gidin ve Arama Al’a basın. “Ara” resmini inceleyin. İlgilenilen bölge ortalanmıyorsa, istediğiniz konuma sağ tıklayın ve ardından Aşamayı Buraya Taşı ve Görüntü Al öğelerini tekrarlayın. Tomogramın başlangıç açısını tanımlamak için Eğme (°) değerini 0,00 (veya sahne alanının işleyebileceği başka bir başlangıç açısı) olarak ayarlayın.İlk tomogram için, istenen tomogram adlandırma kuralının adını ve her tomogram için istenen bulanıklaştırma değerini ayarlamak üzere Defocus’u girin. İsteğe bağlı olarak, Tomo sürüm 5.8’den itibaren, bulanıklaştırma değerleri tek seferde sistematik olarak değiştirilebilir; bunun için Pozisyon Seç’e tıklayın, değiştirilecek pozisyonları seçin veya tüm pozisyonları seçmek için onay işaretini işaretleyin ve ardından Bulanıklaştırmayı Güncelle’ye tıklayın ve parametreleri ayarlayın (Şekil 7A). “Odak” ve “İzleme” alanlarını ayarlayın (Şekil 2C). İzleme ve odak alanlarını (sarı ve mavi daireler) sürüklemek için sol tıklayın. İzleme / odak alanının (çoğunlukla) karbon veya başka bir uygun izleme özelliği, yani ilgilenilen bölgeye benzer bir özellik üzerinde olduğundan emin olun; çatlaklardan, buz kontaminasyonundan, aşırı kalın bölgelerden ve boş deliklerden kaçının.Birçok izleme özelliği olmayan boş karbon seçerken, odaklanma için yeterince yüksek bir doz seçerek ve numuneyi daha yüksek eğimlerde yavaşça yakmak için izleyerek alanın tomogramın yarısına kadar yanmaya başladığından emin olun. Bu, izleme doğruluğunu korumak için yararlı olabilir. İzleme/odak alanının daha sonraki bir edinme alanını göstermediğinden emin olun.NOT: Neyin yakın olduğu ve kirişe neyin gireceği konusunda dikkatli olun. Izgara çubukları da dahil olmak üzere izleme ve/veya pozlamaya müdahale edecek özelliklere sahip alanlardan kaçının. Tüm parametreler ayarlandıktan ve istenen ilgi alanı ile “Odak” ve “İzleme” tanımlandıktan sonra Konum Ekle’ye basın. Yeni hedefler için bu işlemi tekrarlayın.NOT: Ösentrik yüksekliğin, ayarlanmış parti pozisyonları için doğru şekilde kalibre edildiğini kontrol etmek için, birkaç kullanılabilir strateji vardır. Yapılan tomografi seansının türüne göre (moleküler, hücresel, lamel) birini seçmeniz önerilir. Moleküler tomografi için, ızgaraların oldukça düz olduğunu ve hedef konumları içeren her karenin merkezinde ösentrik yükseklik yapıldığını varsayarsak, “Tümünü İyileştir” (veya Pozisyonlar seçilmişse Seçilenleri İyileştir, Şekil 7A) prosedürünü atlayın. Tomo, otomatik ösentrik aşama eğme rutini ile mücadele ediyorsa, muhtemelen Ösentrik Atla’ya tıklayın.Hücresel veya lamel numuneleri için, her parti pozisyonu farklı bir z yüksekliğinde olabilir. Dikkatli olmak için “Tümünü İyileştir” i kullanın veya “Ösantrik Atla” seçeneğini işaretlemeyin.NOT: “Tümünü hassaslaştır”, “Pozisyonları Seç” aracılığıyla ayarlanmış veya seçilmiş tüm tomogramları yineleyecektir; ösentrik yüksekliği hassaslaştırın ve veri toplamadan önce izleme ve odaklanma gerçekleştirin. Bu prosedür, devam etmeden önce göz önünde bulundurulması gereken bir sonraki tomogram odağı/izleme bölgesinden (Şekil 7B) çakışan pozlamayı ortaya çıkarabilir. İyileştirme başarısız olan kareleri kontrol edin ve yeniden ziyaret edin. Seçenekleri görmek için farenin sağ tuşuyla başarısız konuma tıklayın. Ösentrik yükseklik başarısız olursa, “Sahne eğimine göre otomatik ösentrik” (adım 1.4.1.) öğesini bulun, z yüksekliğini güncellemek için yeni bir “Ara” resmi edinin ve “Konum Ekle”. Başarısız/önceden başlatılmış konumu silin. “Tümünü hassaslaştır” ile yapılan Ömerkezci Atla seçeneğine tıklayın.NOT: “Tümünü İyileştir” çalıştırılmazsa, “Ömerkezli’yi Atla” seçeneği işaretlenmemelidir. Tomo5, her tomogram alınmadan önce ösentrik arıtma çalıştıracaktır; bu şekilde, ösentrik arıtmada başarısız olan pozisyonlar atlanacaktır. Aşağıdaki adımları izleyerek otomatik işlevleri gerçekleştirin.Atlasta bir karbon alanına giderek “Otomatik İşlevler” sekmesi aracılığıyla hizalamaları gerçekleştirmek için ayarları kontrol edin. Bu alanı ösentrik yüksekliğe getirin ve aşağıda belirtildiği gibi hizalama sırasını izleyin.” Ösentrik Yükseklik” ön ayarlı sahne eğimine göre Otomatik Ösantrik özelliğini çalıştırın. Otomatik Netleme rutinini “Netleme ” hazır ayarıyla çalıştırın. Autostigmate rutinini “Thon Ring” ön ayarıyla çalıştırın. Autocoma rutinini “Thon Ring” ön ayarıyla çalıştırın. İstenilen objektif diyafram açıklığını (Şekil 6B), muhtemelen 100 μm diyafram açıklığını, artan numune kontrastı ve çok yüksek çözünürlükte sinyalde yalnızca küçük bir kesme için iyi bir uzlaşma olarak yerleştirin. Diyafram açıklığı takıldıktan sonra Autostigmate rutinini tekrarlayın.NOT: Piksel boyutları yaklaşık 3 şve daha düşük çözünürlüklerde olan büyütmelerde, Autocoma yordamı başarısız olabilir; bu durumda, Tomo Rotation Center’ı TEM kullanıcı arayüzündeki Direct Alignments (Doğrudan Hizalamalar) altında kontrol edin ve hizalayın. Numunenizde Otomatik Sıfır Kayıp merkezleme rutininin çalıştığını kontrol edin. “Sıfır Kayıp” ön ayarının oldukça yüksek bir dozda (adım 1.2.3) olmasıyla, Otomatik İşlevler’deki rutinin başarılı olması daha olasıdır. Veri toplama işlemini gerçekleştirin.”Tomografi” sekmesinde otomatik alımı başlatmak için, Veri Toplama levhasını seçin ve istenen parametreleri ayarlayın (Şekil 7C). Veri toplama parametrelerini ayarlayın: Eğim Adımı (°), Maks. Pozitif Açı (°), Maks. Negatif Açı (°), izleme şeması (önerilen: Yakalamadan Önce İzle/Odaklan’ı seçin). Ösentrik yükseklik şeması için Sütun Vanalarını Kapat’ı seçin.NOT: Nadiren kullanılan parametreler “Pozlama Süresini Ayarla”, “ZLP’yi Ayarla”, “Faz Plakasını Kullan” ve “Eğdikten Sonra Duraklat” parametreleridir.Daha yüksek eğimlerde pozlama süresini belirli bir oranda artırmak için STA’ya yönelik olmayan tomogramlar için Pozlama Süresini Ayarla’yı kullanın. ZLP’yi Ayarla seçeneği, periyodiklik ayarından bağımsız olarak her tomogramdan sonra bir ZLP iyileştirmesi çalıştırır. Yavaştır, bazen bariz nedenler olmadan başarısız olur ve bu pozisyon alımını atlar. Bununla birlikte, çok dar yarık genişliği, yani bir Selectris(X) filtresinde 3-5 eV için yararlı olabilir. Kullanım Faz Plakası , enerji filtreli DED’lerin piyasaya sürülmesinden bu yana nadiren kullanılır. Pause After Tilt , edinimi duraklatır ancak yazılımda herhangi bir değişikliğe izin vermez. Veri toplama parametrelerini (“Hazırlık” sekmesinde) iki kez kontrol edin, doz hesaplamasını ve istenen eğim şemasını kabul edin, “Maruz Kalma” ön ayarında Kesirlerin (Nr.) sayısını belirtin ve ardından edinime başlayın.NOT: Fraksiyonların sayısı numuneye, elde etme parametrelerine ve planlanan işlem sonrası adımlara, yani STA ve morfolojik analize bağlıdır ve hareket düzeltmesi ve CTF tahmininin yeterli sinyal aldığı değerlerde tutulmalıdır. 4-10 fraksiyonluk bir aralık iyi bir tahmindir, burada 4 daha kalın numuneler için daha uygundur ve 10 daha ince moleküler numuneler için daha uygundur.Ardından, veri toplamaya başlamak için Başlat’a tıklayın ve tomogramların amaçlandığı gibi alındığından emin olmak için ilk tomogram alımını izleyin.NOT: Son tomografi yazılımı sürümlerinde, edinilen tomogramların izlenebileceği “Tomografi” sekmesinde ek bir Movie Player levhası vardır. Yükleme işlemi sırasında sabırlı olun. 2. emClarity kullanarak apoferritinin Cryo-ET STA’sı NOT: Burada, emClarity yazılımı17, STA tarafından kriyo-ET yapı tayinini göstermek için kullanılmıştır. Örnek olarak altı eğimli apoferritin serisi (EMPIAR-10787) alınmıştır. Oktahedral simetri uygulandı ve son harita sadece 4.800 parçacıktan elde edilen ve Nyquist frekansına (2.68 Å) yakın olan 2.86 şçözünürlüğe sahipti. emClarity yazılım paketi39’un indirildiğinden ve kurulduğundan emin olun (bkz. Yazılım işleme 40 için IMOD’u yükleyin.NOT: Linux komutları hakkında temel bilgi gereklidir. Ribozom veri kümesini (EMPIAR-10304) örnek alan ve adım adım yordamları açıklayan başvuru 41’de daha ayrıntılı bir öğretici bulunabilir. Farklı protein örnekleri için, daha önce yayınlanmış bir rapor da mevcuttur42. Giriş dosyalarını ve dizinleri hazırlayın.NOT: Ham çerçeveler MotionCor2 (yama 5 x 5)43 (bkz. Malzeme Tablosu) tarafından hareket düzeltmelidir. Hareket düzeltmeli görüntüler, newstack (IMOD) kullanılarak tilt serisini oluşturmak için istiflendi ve Etomo kullanılarak yama izleme ile manuel olarak hizalandı (bkz. Malzeme Tablosu), ardından emClarity. Daha iyi hizalamalar elde etmek için, Etomo’da ofsetlerin ve eğim telafisi yapılması önerilir. Altı eğim serisi, TS1 olarak TS6 olarak yeniden adlandırıldı. Aşağıda örnek olarak ilk eğme serisi (TS1) için talimatlar ve komutlar verilmiştir.Bir proje klasörü oluşturun.NOT: Yazılımın en son sürümü 1.5.3.11’dir. İlgili tüm yazılım günlükleri yerel proje klasöründe (…/logFile/emClarity.logfile) bulunabilir. Proje klasörünün altında, “fixedStacks” adlı başka bir yeni klasör oluşturun ve giriş dosyalarını hazırlayın: TS1.sabit, TS1.xf ve TS1.tlt.NOT: TS1.fixed: Etomo’da TS1.st olarak da bilinen orijinal eğim serisi. TS1.xf: Bu dosya, Etomo tiltalign’dan sonraki dönüştürme koordinatlarını içerir. TS1.tlt: Bu dosya eğim açıları içerir. Aşağıdaki adımları izleyerek bulanıklaştırmayı tahmin edin.Bulanıklaştırmayı hesaplayın. Parametre dosyasını, Ek Tablo 1’i takip eden mikroskop ve görüntüleme parametreleri ile güncelleyin. Bir parametre dosyasını proje klasörüne kopyalayın, adını param_ctf değiştirin ve şu komutu çalıştırın: emClarity ctf tahmini param_ctf.m TS1.NOT: parametre dosyası şablonu Ek Dosya 1 veya yerel yazılım yükleme dizininde bulunabilir (…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/). Her yığın için CTF tahmin sonuçlarını denetleyin.3dmod kullanarak hizalanmış yığınları (örneğin, aliStacks/TS1_ali1.fixed) kontrol edin ve güvenilir boncukların doğru şekilde silindiğinden emin olun. Günlük dosyasının, logfile/emClarity.logfile dosyasında bulunabilecek şekilde işlenenin doğru olduğunu bildirdiğinden emin olun (Şekil 9). Bulanıklaştırma değerini kontrol edin (örneğin, fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) ve teorik CTF tahminiyle eşleştiğinden emin olun. Alt bölgeleri tanımlayın.Bağlanmış bir tomogram oluşturun. Proje klasöründe şunu çalıştırın: sh recScript2.sh -1.NOT: Her yığın için daha küçük (boyutlu) bir tomogram yeni bir “bin10” klasöründe saklanacaktır. İşlemi hızlandırmak için, bir veya birkaç alt bölgenin koordinatları bir bin10 tomogramında tanımlanabilir. Komut dosyası yerel yazılım yükleme dizininde olacaktır (…/emClarity_1.5.3.11/docs/). Bir alt bölge oluşturmak için altı nokta, x min, x max, y min, y max, zmin ve z max olmak üzere altı nokta seçerek sınırları belirleyin. “bin10” klasörü altında şunu çalıştırın: 3dmod TS1_bin10.rec.NOT: Bir eğim serisinde dört alt bölge oluşturulacaksa, 6 × 4 = 24 noktayı seçin. Her yığının “bin10” klasörü altında bir model dosyası (*.mod) olmalıdır. Model dosyalarını emClarity biçimine dönüştürün. Bu, yeni bir klasör yeniden yapılandırma oluşturur. Her alt bölgenin tüm koordinatlarını bu klasörün altında depolayın. Proje klasöründe şunu çalıştırın: sh recScript2.sh TS1. Parçacıkları seçin.Parçacıkları toplamak için bir apoferritin şablonu bulun. Elektron Mikroskobu Veri Bankası’ndan (EMD-10101)44 bir şablon indirin. Şablonun piksel boyutunun ham verilerinkiyle eşleştiğinden emin olun. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu. Partikül toplama için CTF ile düzeltilmiş tomogramlar oluşturun. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch. Her alt bölge için parçacık toplamayı çalıştırın. Apoferritin veri kümesi için bin6’da bir şablon araması gerçekleştirin. Düzlem içi veya düzlem dışı aramanın açı aralığını ve aralıklarını derece cinsinden belirlemek için Tmp_angleSearch parametrelerini (θ çıkış, Δ çıkış, θgiriş, Δ giriş) değiştirin. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.NOT: Bu adımda “convmap_wedge_Type2_bin6” klasörü oluşturulacaktır. Bu klasörün altındaki csv dosyası (örneğin, TS1_1_bin6.csv) toplanan parçacıklarla ilgili tüm bilgileri içerir. 3dmod kullanarak yanlış parçacıkları çıkarın. “convmap_wedge_Type2_bin6” klasörü altında şunu çalıştırın: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.NOT: Bu alanlarda karbon kenarlarının veya buz kontaminasyonlarının yanında yanlış parçacıklar bulmak yaygındır. Yanlış noktalara sağ fare tıklaması yapın ve silmek için klavyede geri tuşuna basın. Bu adımda, yanlış pozitif noktaların çoğunun kaldırıldığından emin olun (Şekil 10). “convmap_wedge_Type2_bin6” klasör adını “convmap” olarak değiştirin, çünkü emClarity aşağıdaki adımlarda convmap altında alt bölge bilgilerini bulacaktır. Projeyi başlatın. Proje klasöründe, emClarity, ApoF.mat için bir veritabanı oluşturmak üzere emClarity init param0.m komutunu çalıştırın. STA ve hizalamadan önce tomogram rekonstrüksiyonu gerçekleştirin. bin4’te CTF ile düzeltilmiş alt bölge tomogramları oluşturmak için şunu çalıştırın: emClarity ctf 3d param0.m.NOT: CTF ile düzeltilmiş tomogramlar (örneğin, cache/TS1_1_bin4.rec)  yeni bir “cache” klasöründe oluşturulur. STA ve hizalama gerçekleştirin.Ortalamayı bin4’ten başlayarak CTF ile düzeltilmiş alt tomogramları kullanarak gerçekleştirin. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity ort param0.m 0 RawAlignment. Hizalamalar yapmaya ve çalıştırmaya devam edin: emClarity alignRaw param0.m 0.NOT: Ortalama adımı, bu adımda emClarity tarafından parçacıkları hizalamak için kullanılacak bir referans oluşturur. Raw_angleSearch parametreleri (θ çıkış, Δçıkış, θ giriş, Δgiriş), her döngü için açı aralığını ve adım boyutlarını ayarlamak üzere değiştirilebilir. Çoğu yanlış parçacık veritabanından kaldırıldığından (Adım 2.6.4), hizalama için bu açısal ayarlar nispeten küçük bir derece ile başlayabilir. Raw_angleSearch parametrelerini güncelleyin ve birkaç döngü daha çalıştırın (Adım 2.9.1 ve 2.9.2). İşlemi hızlandırmak için, düzlem içi ve düzlem dışı hizalamaları ayrı ayrı gerçekleştirin.NOT: Her gruplama için, birden çok döngü çalıştırmanız ve açısal ayarları kademeli olarak azaltmanız önerilir. ApoF veri kümesi için, bin 4’te beş döngü daha gerçekleştirilmiştir ve daha fazla ayrıntı Ek Tablo 2’de mevcuttur. cycle001 için proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, ardından emClarity alignRaw param1.m 1. Üst üste binen parçacıkları temizleyin. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity removeDuplicates param5.m 5. tomoCPR ile Tilt serisi iyileştirme gerçekleştirin.NOT: Bu adım isteğe bağlıdır.Yığın geometrisini hassaslaştırmak için tomoCPR’yi çalıştırın. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity tomoCPR param5.m 5. Yeni hizalanmış yığınlar oluşturun ve geometri dosyalarını güncelleştirin. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity ctf update param6.m.NOT: Yeni geometri dosyalarının (örneğin, fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) ve yeni hizalanmış yığınların (örneğin, aliStacks/TS1_ali2.fixed) doğru şekilde oluşturulduğundan emin olun. bin2’de yeni alt tomogramlar oluşturun. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity ctf 3d param6.m.NOT: Bunu, bin2’de ortalama ve hizalama (adım 2.9.1, 2.9.2 ve 2.9.3), yinelenen temizleme (adım 2.9.4) ve isteğe bağlı tomoCPR (adım 2.10) için birkaç döngü izleyecektir. Yüksek simetri nedeniyle, apoferritin için bin2’de beş döngü daha gerçekleştirildi. Her döngü için Raw_angleSearch parametrelerini güncelleyin. Son rekonstrüksiyonu gerçekleştirin.bin1 ve tomoCPR’de birkaç döngü çalıştırmaya devam edin (Adım 2.9 ve Adım 2.10). Apoferritin veri kümesi için bin1’de 10 döngü daha gerçekleştirildi. Komutlar ve parametrelerle ilgili daha fazla ayrıntı Tablo 2’de bulunabilir. İki yarım veri kümesini birleştirerek son yeniden yapılandırmayı gerçekleştirin. Proje klasöründe şunu çalıştırın: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, ardından emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.NOT: Son harita (örneğin, B faktörü 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc olan) oluşturulacaktır, Şekil 11.

Representative Results

Hücresel ve lamel örnekleri için, veri toplama stratejisi büyük ölçüde örneklem ve görüntüleme çalışmasının amacına bağlıdır (Şekil 1). Hedefleme yaklaşımı, moleküler hedefin in situ mu yoksa moleküler hedefler içeren yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyon örnekleri için saflaştırılmış makromoleküler kompleksten mi hazırlandığına bağlıdır. Delikli (karbon) ızgaralara vitrifiye edilmiş saflaştırılmış kompleksler için, hedefleme basitçe (karbon) destek filminin deliklerindeki görüntülemeye dayanabilir. In situ çalışma için, hedefleme yaklaşımı, bağıntılı verilere veya bilinen düşük büyütmeli hücresel yer işaretlerine dayanarak moleküler varlığın yeri hakkında bilgi gerektirir. Hücresel yer işaretleri, genel bakış görüntüleri alınırken ideal olarak tanımlanabilir ve ilgi çekici bölgeleri kabaca yerelleştirmek için yeterliyse, hedef kimliği bir arama görüntüsüyle doğrulamanın hızlı bir yolunu sağlayabilir. Bununla birlikte, gözlemlenebilir olaylar nadirse, hedefin doğru olduğunu nitelemek için orta büyütmeli arama görüntülerine ihtiyaç duyulabilir. Arama haritaları, arama görüntülerinin orta büyütme montajlarıdır ve bu nedenle, hedef bulmayı çok daha kolay hale getirebilir, burada ilgi çekici özelliğin görünür olduğu bir büyütmede elde edilebilirler. Arama haritaları daha sonra hedef toplu iş konumlarını bulmak ve ayarlamak için taranabilir. Ultrayapısal rekonstrüksiyon için hücresel özellikler içeren örnekler için, hedefleme yaklaşımı benzerdir, ancak hücresel olayın çeşitli büyütmelerde görünürlüğüne ve numunedeki prevalansına eşit derecede bağlıdır. Veri toplama stratejisi de dikkate alınmalıdır; Her durumda, çalışmanın amacı büyük ölçüde verilerin nasıl toplandığını belirler. Hücresel ultrayapının rekonstrüksiyonu için, düşük bir büyütme (20-5 ş/ px) ve geniş görüş alanı uygun olabilir, ancak moleküler veya yüksek çözünürlüklü ayrıntıyı (5-1 ş/ px) yeniden yapılandırmak için yüksek büyütmeler gereklidir. İdeal koşullar altında 1,5 Å/px’te toplanan bir veri kümesi yalnızca fiziksel olarak 3,0 Å/px Nyquist frekansında bir rekonstrüksiyon üretebilir; Bununla birlikte, gerçekte, numune kalınlığı, boyutu ve heterojenliği dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok faktör, elde edilen rekonstrüksiyon kalitesini etkiler. Kesin görüntüleme parametreleri ayrıca, çalışmanın amacına dayalı büyütmeyi, yeterli bilgi içerecek görüş alanıyla dengeler. Bu makalede, 2.86 Å’ya ulaşan bir subtomogram ortalamasına sahip bir olgu sunulmaktadır, ancak 17,42,43,44,45 numaralı ek çalışmalar, 17,42,45,46 farklı sonuçları hedefleyen çalışmalarla ilişkili toplama parametrelerini göstermek için Tablo 1’de sunulmuştur. Kriyo-ET için bir hedefleme iş akışı ve veri toplama rejimi oluşturulduktan sonra, birçok farklı numune türünün veri toplanması mümkündür. Çeşitli örneklerin temsili tomogramları burada sunulmaktadır: apoferritin (Film 1), ince hücresel süreçler (Film 2) ve kalın hücresel numunenin FIB öğütülmüş lamelleri (Film 3) gibi moleküler örnekler. Şekil 1: Tomografi iş akışı kurulumuna genel bakış. Protokolde açıklanan kriyo-ET görüntüleme iş akışı bir akış şeması olarak gösterilir. Elde edilmesi beklenen görüntüler hücresel ve moleküler iş akışı için gösterilir. Sunulan adlandırma Tomo5 kuralını takip eder, ancak çoğu tomografi edinme yazılımı bu görüntüleri toplamak için ortak ilkeleri paylaşır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Hazırlık sekmesi ve arama ön ayar koşulları . (A) Tüm sekmenin genel bakış görüntüsü. Görüntüleme koşulu hazır ayarları bu sekmede ayarlanır ve “Görüntü Kaydırmayı Kalibre Et” ve “Görüntü Filtresi Ayarları” “Görevler” açılır menüsünde bulunabilir. (B) Her bir ön ayarın bireysel görüntüleme koşulları kurulumu için seçilebildiği “Ön Ayarlar” açılır menüsünün yakınlaştırılması. (C) Hem pozlamayı hem de “Odak ve İzleme” alanını görüş alanına sığdırmak için yeterli bir büyütmeyi gösteren resim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Doz hesaplamaları. Doz hızının vakum üzerinden ölçüldüğü olası tomogram edinme şemaları için örnek doz hesaplamaları. İki hesaplama, eğim başına en uygun dozu veya tam eğim serisi için en uygun toplam dozu hedefleyip hedeflemediği, her eğim için maruz kalma sürelerini belirler. Subtomogram ortalamasında, eğilmiş görüntü başına 3.0-3.5 e-/Å2 aralığında optimal bir doz hedeflemek yaygın bir uygulamadır. Her iki durumda da, hareket düzeltmesi yapmak için yeterli sinyal için eğimin film karesi başına ~ 0,5 e-/Å2 doz elde etmek için “Kesirler (Nr.)” 6 olarak ayarlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Atlas sekmesi. “Atlas” sekmesine genel bakış görüntüsü. Görüntü, boş ızgara konum boşluklarını önlemek için kırpılmıştır. “Görevler” menüsü, envantere kaydedilen tüm ızgaraların ayrı ayrı seçilmesi için oturum kurulum tercihlerini ve ızgara seçim alanlarını ve kaset otomatik yükleyiciden çıkarıldıktan sonra tek bir atlas alma seçeneğini içerir. Seçilen bir kılavuz sıfırlanabilir ve ardından yeniden edinilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Kalibre edilmiş görüntü kaymaları. Resim, bir pozlama ve arama resmini gösterir. Arama görüntüsündeki kırmızı çarpı işareti, pozlama ve arama arasındaki dengeyi düzeltmek için kaydırılan işaretleyicidir. Oturum başlangıcında veya görüntüleme koşulu ön ayarlarını değiştirdikten sonra görüntü kaydırma kalibrasyonları yeniden yapılmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Otomatik fonksiyonlar ve diyafram açıklıkları . (A) “Otomatik İşlevler” sekmesi, “Ön Ayarlar” açılır menüsünü ve “Görev” seçimini gösterir. Mavi renkle altı çizili, “Autostigmate” (ayrıca mavi ile altı çizili) ve “Autocoma” için gerekli olan “Thon Ring” ön ayarıdır. Her görev için ilgili hazır ayarlar seçilmeli ve ardından Başlat düğmesine basılmalıdır. (B) Açıklıklar TEM Kullanıcı Arayüzünde bulunur. Otomatik işlevler gerçekleştirildikten sonra istediğiniz “Objektif diyafram” ı seçin ve diyafram açıklığı ile “Autostigmate” i çalıştırın . Şekil 7: Tomografi sekmesine genel bakış. Görüntüler Tomo 5.8 kullanıcı arayüzünü göstermektedir. (A) Toplu iş pozisyonları. Resimde gösterilen en son işlevler: “Arama Haritasını Al” seçeneği; tomogram konumları atlas görünümünde yakınlaştırma seçeneğiyle gösterilir; sağ üstte vurgulanan “Pozisyon Seç”; “Bulanıklaştırmayı Güncelle” parametreleri için dört konumun tümü seçilmiştir. (B) Arama haritasında 1, 2 ve 3 etiketli üç konum seçilir. Konum 1, “Tümünü İyileştir” çalıştırıldığında bir sorun teşkil etmeyecektir. Bununla birlikte, konum 2 ve konum 3 için gösterildiği gibi, lamel konumları seçildiğinde olduğu gibi yüksek bir hedef yoğunluğu ayarındaysa, “Tümünü İyileştir”, konum 2’nin “Pozlama” bölgesinde “İzleme” ve “Odak” rutinini çalıştıracak ve tomogram alınmadan önce hedefi açığa çıkaracaktır. Izgara türü R1.2/1.3’tür. Ölçek çubuğu = 1,2 μm. (C) Veri toplama. “Toplu Pozisyonlar”da ayarlanan seçili pozisyonlar artık ayrı ayrı alınabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Maksimum eğim açısının tanımlanması. Şekil, tomogram alımları için maksimum eğim aralığını belirlemeye yönelik adım adım bir yaklaşımı göstermektedir. (A) 0° genel bakış ve ızgara karesinin ortasında bir arama haritası. Eğim aralığını test etmek için tomografi yazılımında “Set Tilt (°)” ile istenilen değer yazıp Set tuşuna basılarak açı ayarlanabilir. (B) Sahne alanı -60°’ye eğilmiştir, bu da arama haritasının bir köşesinin -60°’de tam olarak elde edilmeyeceğini gösterir. (C) Sahne 60°’ye kadar eğilmiştir. ±60 ° ‘de kaybolan delikleri sayarak, bir ızgara karesinin eğim aralığı hakkında bir fikir edinilebilir. Ölçek çubukları = 2,5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: emClarity akış şeması. Akış şeması, kriyo alt-tomogram ortalaması için çeşitli adımları açıkladı. Ölçek çubukları = 50 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: emClarity kullanarak şablon eşleştirme . (A) Grafen kaplı bir ızgara üzerinde tipik bir apoferritin mikrografı. Bulanıklaştırma: -3,430 μm. (B) Şablon aramasından sonra model noktalarıyla kaplanmış tomogramın bir dilimi. (C) Bir üst kısım ve (D) monodispers apoferritin parçacıklarının tek bir düz tabakasını gösteren model noktalarının bir yan projeksiyon görünümü. Ölçek çubukları = 50 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: Apoferritinin Cryo-ET STA’sı . (A) 21 döngü sub-tomogram hizalamasından sonraki son harita. (B) Son haritanın Fourier kabuk korelasyonu (FSC) grafiği, 38 koni FSC içeren, bildirilen 2.86 şçözünürlüğe sahip. (C) Temsili yoğunluk haritaları (PDB model 6s6147 ile donatılmıştır). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Örnek Cryo-ET tipi Å/px Eğme aralığı (+/-) Eğme adımı (°) Bulanıklaştırma aralığı (μm) Toplam doz (e-/Å2) Çözünürlük Ham veri Referans Apoferritin Saflaştırılmış/Moleküler (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 EMPIAR-10787 17 & bu kağıt HIV-1 Gag Saflaştırılmış/Moleküler (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17 Ribozom Saflaştırılmış/Moleküler (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 EMPIAR-10304 42 SARS-CoV-2 ani artışı Lamel/Moleküler (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 EMPIAR-10753 45 Nöron akson yapısı Hücresel (ultrayapısal) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 N.D. EMPIAR-10922 47 Tablo 1: Birkaç kriyo-ET çalışması için toplama parametreleri. Saflaştırılmış veya in situ proteinlerden moleküler detayın rekonstrüksiyonunu hedefleyen çalışmalar, ultrayapısal hücresel özellikleri çözmeyi ve segmentlere ayırmayı amaçlayan bir çalışmaya kıyasla. Film 1: Normal bir EM ızgarası üzerinde apoferritin örneklerinin bir tomogramı ve daha sonra uyumlu bir filtreye sahip ultra yüksek çözünürlüklü bir kamera ile donatılmış bir kriyo-TEM ile görüntülendi. Tilt serisi, elektron tomografi yazılımında 54° eğim açıklığı ve toplam 134 e-/A2 dozu ile doz-simetrik şema ile elde edildi. Ölçek çubuğu = 50 nm. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız. Film 2: Bir EM ızgarasında yetiştirilen ve daha sonra uyumlu bir filtreye sahip ultra yüksek çözünürlüklü bir kamera ile donatılmış bir kriyo-TEM ile doğrudan görüntülenen birincil nöronun bir tomogramı. Eğim serisi, elektron tomografi yazılımında 60 ° ‘lik bir eğim açıklığı ve toplam 120 e-/A2 dozu ile doz-simetrik bir şema ile elde edildi. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız. Film 3: Bir EM ızgarası üzerindeki bir Siyanobakterilerin bir tomogramı, FIB frezelemeye tabi tutulur ve daha sonra yüksek hızlı bir kamera ve uyumlu bir filtre ile donatılmış bir kriyo-TEM ile görüntülenir. Eğim serisi, elektron tomografi yazılımında 50 ° ‘lik bir eğim açıklığı ve toplam 120 e-/A2 dozu ile doz-simetrik bir şema ile elde edildi. Ölçek çubuğu = 87,2 nm. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosya 1: Bulanıklaştırmayı tahmin etmek için kullanılan parametre dosyası şablonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Tablo 1: Veri toplama ve mikroskop kurulum ayrıntıları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Tablo 2: Komutların yürütme sırasına göre listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Tomo5 ·
Tomografi yazılımının iş akışı açıklaması, (uzak) toplu tomografi oturumu kurulumu için potansiyel ve en akıcı yolu vurgulamaktadır. Yazılım yeni başlayanlar için kolay olsa da, bazı ilk kriyo-EM deneyimi ve temel tomografi anlayışı kuruluma yardımcı olabilir. Kritik adımlar protokolde vurgulanır ve farklı bir kurulum yaklaşımı kullanılmış olsa bile sorun gidermeye yardımcı olmalıdır. Yazılımın ilerlemesi (uzak) veri toplamayı kolaylaştıracak ve cryo-ET’yi geniş bir kullanıcı tabanı için daha erişilebilir hale getirecektir. Sık karşılaşılan sorunların giderilmesine yardımcı olabilecek birkaç ipucu ve püf noktası aşağıda açıklanmıştır.

Tartışılması gereken önemli bir nokta, ızgaraların seçimidir, çünkü numuneyi ±60°’ye yatırırken, yüksek eğimli ızgara çubukları görünümü gizleyebilir (Şekil 8). Bir TEM ızgarasında, ağ boyutu, ızgaranın birim uzunluğu başına ızgara karelerinin sayısını ifade eder. Daha büyük örgü numaraları, birim uzunluk başına daha fazla ızgara karesine, daha yüksek bir ızgara karesi yoğunluğuna ve daha küçük ızgara karelerine sahiptir, yani 400 örgülü bir ızgara, 200 örgülü bir ızgaradan daha küçük karelere sahiptir. Tomografi için iyi bir ızgara seçimi 200 mesh veya 300 mesh ızgaralardır. Şekil 8’de gösterildiği gibi, ızgara eğildikçe toplanacak kullanılabilir alan azalır. ±60° eğimde, 300 meşallik bir ızgara, üzerinde tam bir tomogramın elde edilebileceği küçük bir görüş alanına sahip olacaktır. 200 örgülü ızgaraların avantajları, daha büyük ızgara karelerinin moleküler tomografi kurulumunu daha hızlı hale getirmesi ve artan ızgara-kare alanı ile bir gecede toplama için bir karenin yeterli olacağıdır. Dezavantajı, 200 örgülü ızgaraların daha kırılgan olmasıdır, bu nedenle kullanım ve kırpma daha fazla incelik gerektirir.

Ayrıca, EM ızgaralarında delikli destek filmi kullanılıyorsa ( bakınız Malzeme Tablosu), pozlama bölgesi ile ilgili olarak odak ve izleme bölgesinin kurulumu için delik aralığı dikkate alınmalıdır. İdeal olarak, istenen büyütmedeki ışın çapı, optimum ve hızlı kurulum için eğim ekseni boyunca pozlama alanına bitişik karbon alanını kaplayacak kadar küçük olmalıdır. Bu şekilde, her delikteki potansiyel ilgi alanları elde edilebilir.

Yazılımın ösentrik yükseklik rutini şu anda serialEM rutini gibi sağlam olmadığından, aşağıdaki ipuçları bu sorunu çözebilir. Ösentrik yükseklik belirleme ösentrik yükseklik ön ayarı kullanılarak başarısız olursa, bunun yerine genel bakış ön ayarı kullanılabilir ve “Sahne eğimine göre otomatik ösentrik” yeniden çalıştırılabilir; bu, ösentrik yükseklik 0’dan uzaksa sorunları çözebilir. Bu başarılı olursa, hassasiyeti artırmak için “Sahne eğimine göre otomatik ösentrik” i “Ösantrik Yükseklik” ön ayarlarıyla yeniden çalıştırabilirsiniz. Başarısız olursa, ösentrik yükseklik ön ayarıyla “Işın eğimi ile otomatik-Ösentrik” çalıştırılabilir ve ardından “Sahne alanı eğimiyle otomatik-Ösantrik” i yeniden çalıştırabilir veya “Sahne Alanı” ayarları altında TEM Kullanıcı Arayüzünde “Işın eğimi ile otomatik-Ömerkezli” ile konsolide edilen z yüksekliğini manuel olarak ayarlayabilir. Tekrarlanan bir delik desenine sahip ızgaraların kullanılması durumunda, tek bir çapraz korelasyon zirvesinin tanımlanmasını engelleyebilirler. Ösentrik yükseklik ön ayarını, delik desenlerinden çapraz korelasyonu azaltmak için -25 μm ve / veya daha kısa bir pozlama süresi gibi daha düşük bir bulanıklaştırma ofsetine değiştirmeyi deneyebilirsiniz. Öte yandan, dantel ızgaraları / lamel kullanmak, güçlü bir çapraz korelasyon zirvesi için yeterli sinyal sağlamayabilir. Ösentrik yükseklik ön ayarını, çapraz korelasyon zirvesini geliştirmek için -75 μm ve / veya uzatılmış pozlama süresi gibi daha büyük bir bulanıklaştırma ofsetine değiştirmeyi deneyebilirsiniz. Başka bir seçenek de görüntü filtresi ayarlarını yapmaktır; “Hazırlık” sekmesinde bulunabilirler. Filtre ayarlarını yapma seçenekleri, her bir ön ayar için en uygun çapraz korelasyon zirvesini bulmak üzere düşük (Genel Bakış/Izgara Karesi), orta (Ösantrik Yükseklik) ve yüksek büyütme (İzleme/Odak) olarak ayarlanabilir. Gerekli giriş, bir görüntüdür, yani 0° ve 5°’de bir görüntüdür ve ardından her iki görüntüyü de karşılaştırmak için Karşılaştır’ı tıklayın. En uzun dalga boyu için önerilen başlangıç değeri, görüntüdeki ölçek çubuğunun dörtte biridir ve en kısa dalga boyu için ölçek çubuğunun kırkta biridir. Tepe noktası sağlam bir şekilde tanımlanmazsa, ikna edici bir tepe noktası bulunana kadar ayarları optimize edebilirsiniz. Her seferinde görüntüleri yeniden elde etmeye gerek yoktur; sadece “Karşılaştır” düğmesine basmak yeterlidir. TOMO hala ösentrik yüksekliği otomatik olarak bulamazsa, manuel ösentrik yükseklik kalibrasyonu kullanılabilir. “Hazırlık” sekmesindeki genel bakış büyütmesinde oldukça büyük bir buz kristalinin üzerine ortalanmalı, ardından TEM Kullanıcı Arabirimi’nin “Sahne Kontrolü” ne gitmeli, alfayı -30 ° ‘ye ayarlamalı ve floresan ekran görüntüsünü kullanarak kristali yeniden ortalamak için sahne z-değerini ayarlamalıdır. TEM Kullanıcı Arayüzü’nde “Yüksek Çözünürlük” ve “Yüksek Kontrast” ayarlarını seçmek bunu kolaylaştıracaktır (floresan ekran penceresinin altındaki düğmeler). İsteğe bağlı olarak, canlı moda sahip bir kameraya erişim varsa, ösentrik yüksekliği belirlemek için bu kullanılabilir; floresan ekrandan daha kolay olacaktır.

5.8’den önceki Tomo5 versiyonlarındaki en büyük sınırlamalar, eksik orta büyütme montajları, eksik doz simetrik şeması ve ösentrik yükseklik bulgusu ile ilgili problemlerdir. Bunlar, hızlı geliştirme ve topluluk desteğine sahip ücretsiz bir yazılım, sağlam bir ösentrik yükseklik rutini ve komut dosyası oluşturma seçeneği, yani özel olarak oluşturulmuş bir doz simetrik şeması olan serialEM’de bulunur. Tomo5’te sürüm 5.8’den itibaren, ösentrik yüksekliği bulmak için en sık karşılaşılan sorun, yani hedef z-değeri etrafında başarısız bir döngü, ösentrik yükseklik kabul kriteri belirleme seçeneği uygulanarak çözülmüştür. Bununla birlikte, farklı ızgara ve numune tiplerinde, görüntü filtresi ayarlarının bireysel oturumların benzersiz görüntüleme koşullarını yansıtacak şekilde ayarlanması ve ösentrik yüksekliği bulmak ve tomogram alımı sırasında odak ve izleme bölgesinin güvenilir bir şekilde çalışması için mümkün olan en iyi çapraz korelasyon zirvesini vermesi şiddetle tavsiye edilir.

Genel olarak, birçok tesis pandemi sırasında uzaktan çalışmaya hızla adapte oldu. Tomo5 yazılımı, uzaktan çalışma için çok uygun olan tomografiye kolay erişim ve kullanıcı dostu bir yol sağlar. Yazılımda yapılan ilerlemeler şüphesiz uzaktan veri toplamayı ve tomografi toplamayı genel olarak toplumda daha yaygın hale getirmeye devam edecektir.

emNetlik
emClarity şablon tabanlı bir parçacık toplama yöntemi kullandığından, ilgilenilen nesne için bir şablona ihtiyacı vardır. Parçacık toplama (adım 2.6) çok hassastır ve nihai yapının anahtarıdır. Ortalama alma ve hizalamadan önce (adım 2.9), yanlış pozitifleri dikkatlice kontrol ettiğinizden ve manuel olarak kaldırdığınızdan emin olunmalıdır. Bir şablon mevcut olmadığında, emClarity’nin kullanımı kolay olmayabilir, ancak ilk modeli oluşturmak için Dynamo37 ve PEET48 gibi başka yazılımlar kullanmak mümkündür.

Heterojen numuneler için emClarity, kullanıcıların farklı ölçeklere sahip belirli özelliklere odaklanmalarını sağlayan bir sınıflandırma yöntemiyle donatılmıştır. Sınıflandırmadan önce birkaç hizalama döngüsü çalıştırmak ve daha yüksek bir bağlamada (bin 4 veya bin 3 gibi) çalıştırmak yararlıdır.

Yazılımın güncel sürümü (V1.5.3.11), ilk sürüme (V1.0)17 kıyasla önemli güncelleştirmelere sahiptir. Bunlar, CTF tahmini sırasında bir el kontrolü (adım 2.3); hizalamalar için simetri (CX, I, I2, O); parçacık başına 3D örnekleme fonksiyonlarının hesaplanması (3DSF); uyumluluk ve kararlılık için MATLAB 2019a’ya geçiş; ve ham projeksiyon görüntüleri (cisTEM) kullanılarak yeniden yapılandırma. Yazılım çeşitli örnekler için gelişmeye devam edecek ve en yeni duyurular çevrimiçi olarak bulunabilir ( bkz.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wellcome Trust, MRC ve BBRSC tarafından finanse edilen İngiltere’nin ulusal Elektron Biyo-Görüntüleme Merkezi’ndeki (eBIC) kriyo-EM tesislerine erişim ve destek için Elmas Işık Kaynağı’na teşekkür ederiz. Ayrıca Apoferritin tomogramının (Film 1) satın alınması için Andrew Howe’a, nöron tomogramının hazırlanması ve satın alınması için Ishika Kumar’a (Film 2) ve Siyanobakteri lamel-tomogramı için Craig MacGregor-Chatwin’e (Film 3) teşekkür ederiz.

Materials

Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG – Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil – A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan –
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific –
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ – – Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ – – Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial – – Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software – – Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki – – Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461 (2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -. T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. . The IMOD Home Page Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020)
  41. . GitHub: emClarity-tutorial Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021)
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. . MotionCor2 Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016)
  44. . Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022)
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  47. . Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019)
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Tags

Cryo-electron TomographyRemote Data CollectionSubtomogram AveragingCROWETMicromoleculesNative Cellular EnvironmentTomo Five SoftwareImage Acquisition ParametersAtlasScreeningTarget SetupImage Shift CalibrationEucentric Height AdjustmentLow Dose Tomography Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image