JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63923
, , ,
1Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics,University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute,University of Oxford

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

Abstract

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים (cryo-ET) צוברת תאוצה בשנים האחרונות, במיוחד מאז כניסתם של גלאי אלקטרונים ישירים, אסטרטגיות רכישה אוטומטיות משופרות, טכניקות הכנה המרחיבות את האפשרויות של מה שמיקרוסקופ האלקטרונים יכול לדמות ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-ET ותוכנה חדשה לחישוב תת-טומוגרמה. בנוסף, רכישת נתונים הפכה ליעילה יותר ויותר, מה שהופך אותם לנגישים יותר למשתמשים רבים. מגיפת SARS-CoV-2 האיצה עוד יותר את איסוף הנתונים של מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים מרחוק (cryo-EM), במיוחד עבור cryo-EM של חלקיקים בודדים, במתקנים רבים ברחבי העולם, ומספקת למשתמש גישה ללא הפרעה למכשירים חדישים במהלך המגיפה. עם ההתקדמות האחרונה ב- Tomo5 (תוכנה לטומוגרפיה של אלקטרונים תלת-ממדיים), איסוף נתוני cryo-ET מרחוק הפך חזק וקל לטיפול מכל מקום בעולם. מאמר זה נועד לספק הדרכה מפורטת, החל מהגדרת איסוף הנתונים בתוכנת הטומוגרפיה לתהליך של מפגש איסוף נתונים (מרחוק) cryo-ET עם פתרון בעיות מפורט. פרוטוקול איסוף הנתונים (המרוחק) משלים עוד יותר את זרימת העבודה לקביעת מבנה ברזולוציה כמעט אטומית על ידי תת-טומוגרמה ממוצעת עם emClarity, תוך שימוש באפוסטריטין כדוגמה.

Introduction

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) ידועה כמי שחוותה תקופת רנסנס, והאיצה אותה להיות כלי מרכזי ושימושי בביולוגיה מבנית. פיתוח ושימוש בגלאי אלקטרונים ישירים 1,2,3, שיפור מיקרוסקופים ומקורות אלקטרונים3,4,5, שיפורים באוטומציה/תפוקה 6,7,8,9, והתקדמות חישובית באנליזה של חלקיקים בודדים10,11,12,13 ,14 וטומוגרפיה15,16,17 אחראים, בין השאר, להצלחה האחרונה של הטכניקה. מניעים טכנולוגיים אלה פיתחו את היכולת של cryo-EM לפתור מבנים מקרומולקולריים ביולוגיים בתנאים קריוגניים וטבעיים. הרזולוציות הניתנות להשגה בקלות מספיקות למידול מדויק מבחינה אטומית והביאו את הטכניקה לחזית זירת הביולוגיה המבנית. גישה רדוקציוניסטית לביטוי וטיהור מטרה ביולוגית מעניינת הוכחה זה מכבר כמוצלחת בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית (MX) למחקר ביולוגי בסיסי, גילוי תרופות ומדע תרגומי. באותה גישה, cryo-EM יכול כעת לספק תוצאות מקבילות למחקרי MX ברזולוציה גבוהה. ההצלחה הגדולה הנוכחית בענף cryo-EM של ביולוגיה מבנית נקראת אנליזה של חלקיקים בודדים (SPA), אשר רוכשת תמונות הקרנה דו-ממדיות בדרך כלל של דגימת חלבון מטוהרת18 כדי לקבל אלפי צפיות של מקרומולקולה ביולוגית19. תמונות אלה (1) מכילות מידע ממגוון תצוגות המייצגות באופן מלא את הכיוונים של המטרה במרחב התלת-ממדי ו-(2) לוכדות את ההטרוגניות הקונפורמית של האובייקט, שמאוחר יותר ניתן להפריד ולחקור אותה.

גישה חלופית לרכישת תמונות הקרנה דו-ממדיות אלה של דגימות ביולוגיות, אפילו באתרן וללא טיהור, היא טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryo-ET). Cryo-ET מצלם סדרה של תמונות של אותו אובייקט בזוויות מוטות על ידי סיבוב מכני של הדגימה. לפיכך, ההקרנות הדו-ממדיות שנאספו ב-SPA, המייצגות את התנוחות הזוויתיות של המולקולה המעניינת, נאספות באופן אינהרנטי כחלק מניסוי ההדמיה cryo-ET20. סדרות הטיה טומוגרפיות משוחזרות לאחר מכן לטומוגרמה המכילה ייצוגים תלת-ממדיים של קומפלקסים מקרומולקולריים מצולמים. אופי איסוף הנתונים הטומוגרפיים אכן מקטין במידה מסוימת את ההסתמכות על ממוצע כדי להשיג ייצוג תלת-ממדי מלא של מולקולה מתוך אוסף של תמונות דו-ממדיות. עם זאת, בשל עיצובי השלבים הנוכחיים, הדגימה מוטה בדרך כלל מ- −60° ל- +60°, ומשאירה טריזחסר של 21 מידע בשחזור התלת-ממדי הטומוגרפי.

השחזורים התלת-ממדיים בטומוגרמה אחת כוללים טריז חסר של מידע ואות נמוך לרעש. מקרומולקולות בודדות עשויות להיות מופקות כתת-טומוגרמות וממוצען יחד כדי להתמודד עם זה. כאשר כל מקרומולקולה בתת-טומוגרמה נמצאת בכיוון שונה, הטריז החסר מכוון באופן שונה בכל תת-טומוגרמה של אובייקט המטרה, כך שממוצע על פני עותקים רבים ממלא מידע עקב הטריז החסר. ההתפתחויות האחרונות בעיבוד תמונה ניסו גם לאמן רשתות עצביות של בינה מלאכותית למלא את הטריז החסר בנתונים משמעותיים22. תהליך ממוצע זה גם מגביר את האות לרעש, בדומה למטרה של ממוצע בניתוח חלקיקים בודדים, כך שאיכות השחזור והרזולוציה שלו משתפרות. אם המולקולה המעניינת היא בעלת סימטריה, גם זה עשוי להיות מוגדר ומופעל במהלך הממוצע, מה שמשפר עוד יותר את רזולוציית השחזור. מיצוי נפחים תלת-ממדיים של מקרומולקולה מטומוגרמה לקבוצה של תת-טומוגרמות ועיבודן לאחר מכן נקרא תת-טומוגרמה ממוצעת (STA)23. כאשר כל תת-טומוגרמה מייצגת עותק ייחודי של המולקולה הנחקרת, ניתן לחקור כל הטרוגניות מבנית באמצעות זרימת העבודה של STA. כפי שמקובל להשתמש בתהליך העבודה של SPA, ניתן להשתמש בטכניקות סיווג במהלך STA כדי לנתח את המצבים הקונפורמיים של מכלול העניין. בנוסף ל-STA המאפשר שחזור ברזולוציה גבוהה ב-cryo-ET, גישה זו הופכת את הטכניקה לכלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים המבניים של מקרומולקולות בסביבה התאית הטבעית שלהן או של מטרות שלעתים קרובות אינן מקובלות על SPA24,25,26.

לטומוגרפיה של אלקטרונים יש היסטוריה ארוכה של קביעת המבנה האולטרה-ממדי התלת-ממדי של דגימות תאיות בטמפרטורת החדר27. רכישת תצוגות על ידי הטיה פיזית של הדגימה מספקת מספיק מידע לשחזור תלת-ממדי של אובייקט בסקאלות באורך תאי, והיא חשובה במיוחד כאשר מבנים תאיים חסרים את הסדירות לממוצע. תאים עשויים גם להיות מוקפאים על מצעים לצורך הדמיה cryo-ET בקצוות התא שבהם הדגימה דקה מספיק כדי להיות שקופה אלקטרונים. בתנאים אלה, ניתן להשתמש ב-STA כדי לקבוע מבנים מקרומולקולריים בסביבה תאית, אם כי כאשר הדגימה דקה מספיק כדי להיות אלקטרון שקוף28. עם זאת, בשילוב עם טכניקות הכנה נוספות, כולל אור קריו-קורלטיבי ומיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-CLEM) וכרסום קרן יונים ממוקד (cryo-FIB), cryo-ET יכול לשמש להדמיה בתוך תאים שלמים בתנאים קריוגניים29. זה מפגיש את הכוח של cryo-ET לחקור את האולטרה-מבנה התאי עם הכוח של STA כדי לקבוע את המבנים של קומפלקסים מקרומולקולריים באתרם תוך זיהוי המיקום התאי שלהם30 ומתן תמונות של קומפלקסים העוסקים בתהליכים דינמיים31. היכולת של הטכניקה לדמות דגימות תאיות ולהשתמש ב-STA במספר מחקרים הדגישה את כוחה של הטכניקה לפתור מבנים מקרומולקולריים באתרם, אפילו ברזולוציות דומות ל-SPA32. יתרון נוסף נמצא בידע על המיקום המקורי של המקרומולקולה, המיוצג על ידי השחזור התלת-ממדי המסווג הסופי בטומוגרמה30. לכן, המבנה המקרומולקולרי יכול להיות מתואם עם אולטרה-מבנה התא. תצפיות אלה על פני סולמות אורך יובילו ככל הנראה לממצאים חשובים שבהם מנגנונים מבניים עשויים להיות מתואמים עם שינויים תאיים בהקשר של מחקרים פונקציונליים.

Cryo-ET ו- STA מאפשרים איסוף נתונים בשלוש זרימות עבודה עיקריות: טומוגרפיה מולקולרית, סלולרית ולמלה. המבנים של קומפלקסים מקרומולקולריים מטוהרים עשויים להיקבע על ידי cryo-ET על ידי טומוגרפיה מולקולרית. קביעת מבנים חלבוניים בסביבה התאית שלהם שבה התא דק מספיק עשויה להיות מתוארת כטומוגרפיה תאית. לאחרונה, עם התפתחות המיקוד והטחינה הקריוגניים, אותן טכניקות עשויות להיות מיושמות בתהליכי עבודה של טומוגרפיה של למלה כדי לקבוע את מבני החלבון בעומק התא בסביבתם הטבעית, תוך חשיפת ההקשר התאי שבו חלבונים אלה נצפים. ניתן להשתמש באסטרטגיות איסוף נתונים שונות בהתאם לחבילות התוכנה הזמינות, והכי חשוב, בהתאם לדרישת הדגימה. דגימות מולקולריות או לא דביקות ברשת TEM מנחושת של חלבון מטוהר דורשות בדרך כלל פחות טיפול, ולכן נשארות שטוחות ולא ניזוקות במקרים אידיאליים. ניתן להגדיר בקלות טומוגרמות אלקטרונים בסדרות על פני רשת פחמן חורים כדי להשיג במהירות עשרות עד מאות טומוגרמות באופן שיטתי. הדרך הפשוטה ביותר עבור משתמשים להגדיר דגימות טומוגרפיה מולקולרית שבהן חלבונים נמצאים בשפע ברשת היא להשתמש ב- Tomo5 (תוכנה לטומוגרפיה של אלקטרונים תלת-ממדית המשמשת במחקר הנוכחי, ראה טבלת חומרים). תוכנות טומוגרפיה אחרות כגון Leginon9 ו- serialEM6 זמינות גם כן; הם מציעים אפשרויות הגדרה רבות יותר לגישות מותאמות אישית יותר לאיסוף נתונים, אך הם מורכבים יותר וכתוצאה מכך יכולים להיות קשים יותר לניווט, במיוחד עבור משתמשים חדשים בטומוגרפיה ומשתמשים הניגשים להפעלה שלהם מרחוק. עבור מתקן עם בסיס משתמשים גדול ומגוון, Tomo5 קל לתפעול בסביבה מרוחקת ולהכשרת משתמשים פנימה. עבור תאים דבקים, רשתות דורשות בדרך כלל יותר שלבי טיפול, והצורך להשתמש ברשתות זהב שבריריות מגביר את הצורך בטיפול משופר באסטרטגיות טיפול ואיסוף נתונים. כדי להקל על מציאת אזור סלולרי מעניין ולמנוע חסימה מהרשת עצמה בזוויות הטיה גבוהות, כדאי גם להשתמש בגדלים גדולים יותר של רשת, אך במחיר שהם שבירים יותר מטבעם. עבור דגימות lamella, השבריריות של המדגם נקבעת על ידי איכות lamella, אשר יכול להיות משתנה. גורמים אלה מגדילים את זמן ההתקנה ואת השיקולים, אך יכולת ההסתגלות והחוסן המוגברים שוב הופכים את Tomo5 למתאים לסוג זה של איסוף נתונים. עם זאת, קיימים תרחישי איסוף נתונים מיוחדים עבור כל זרימת עבודה. BISECT ו- PACE-tomo (שניהם פועלים ב- SerialEM) מציגים את האפשרות של הזזת תמונת קרן סקריפטית במהלך רכישת טומוגרפיה כדי להגביר את מהירות איסוף הטומוגרמה28, במיוחד בטומוגרפיה מולקולרית. מונטאז’ים של הגדלה בינונית (MMM) ב- SerialEM 6,7,33 יכולים לזהות טוב יותר ולמקד במדויק תכונות מולקולריות בכל זרימות העבודה, אם כי, בזמן הכתיבה, תכונות אלה מתחילות להיות מיושמות ב- Tomo5.

כמו SPA, cryo-ET ו- STA הופכים לנגישים יותר ויותר באמצעות השיפורים שבוצעו בתוכנת הרכישה ושפע של חבילות זמינות עבור תת-טומוגרמה בממוצע 16,17,32,34,35,36,37,38. בנוסף, במהלך המגפה, מתן גישה מרחוק למכשור cryo-EM הפך חיוני להמשך פעולתם של מתקנים לאומיים כמו מרכז הביו-הדמיה של אלקטרונים (eBIC) במקור אור יהלום (DLS), בריטניה. התפתחויות אלה הפכו את cryo-ET לנגיש וחזק יותר עבור חוקרים המעוניינים להשתמש בטכניקה. לאחר רכישת הנתונים, STA הוא כלי חיוני לניתוח אובייקטים חוזרים ונשנים כדי להשיג שחזור ברזולוציה מקסימלית ולאפשר סיווג של הטרוגניות מקרומולקולרית. הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק סקירה מפורטת של הכנת מיקרוסקופ cryo-TEM לאיסוף נתוני cryo-ET וכיצד לבצע ממוצע תת-טומוגרמה באמצעות emClarity על מערך נתוני טומוגרפיה מולקולרית של אפופריטין כדוגמה. השימוש ב-emClarity (תוכנה לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה וממוצע תת-טומוגרמה, ראו טבלת חומרים) דורש הרצת סקריפטים משורת הפקודה, כך שמניחים רמה של היכרות עם מערכות לינוקס/UNIX.

החיבור מרחוק תלוי בסביבת הרשת בכל מכון/מתקן. ב- eBIC, המערכת המרוחקת משתמשת בתוכניות המאפשרות איסוף נתונים מרחוק בתצורת הרשת הספציפית המשמשת ב- Diamond. חיבור מרחוק למיקרוסקופ מתאפשר על ידי שתי פלטפורמות: NoMachine ו- TeamViewer (ראה טבלת חומרים). באמצעות התוכנית NoMachine, המשתמש יכול להיכנס לשולחן עבודה מרוחק של Windows. שולחן העבודה המרוחק של Windows המסופק על ידי NoMachine שוכן באותה רשת כמו המיקרוסקופ, ובכך פועל כמחשב תמיכה וירטואלי למיקרוסקופ. ממחשב התמיכה הווירטואלי, המשתמש מתחבר למיקרוסקופ באמצעות TeamViewer ומספק גישה ובקרה ישירה למחשב המיקרוסקופ שבו פועל TUI ו-Tomo.

הפרוטוקול הנוכחי מורכב משני חלקים (שלב 1 ושלב 2). שלב 1 מתמקד בקליטת נתונים מרחוק של cryo-ET באמצעות Tomo5 (תוכנה לטומוגרפיה של אלקטרונים תלת-ממדיים). ההדרכה עבור הפעלה (מרוחקת) לוכדת תמונות בהגדלות גבוהות יותר ויותר כדי לאפשר בסופו של דבר למשתמש לכוון את תוכנת הטומוגרפיה להתמקד באזורי דגימה לאיסוף נתונים טומוגרפיים. איור 1 מסכם את התהליך הזה. שלב 2 מפרט עיבוד נתונים של cryo-ET STA באמצעות emClarity (תוכנה לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה וממוצע תת-טומוגרמה). איור 9 מסכם את התהליך הזה.

הפרוטוקול מיועד לקהל מרוחק. היא מניחה שהאדם שנמצא פיזית במיקרוסקופ וטעינת הדגימות עשה את היישורים הישירים ודאג לכוונון המצלמה ולרכישת ייחוס. עבור פרוטוקול זה, מערכת עדשה של שלושה קונדנסור עם autoloader הוא הניח. לקבלת הנחיות מפורטות נוספות על תוכנת הטומוגרפיה, מדריך מפורט של היצרן זמין בלחצן התחל של Windows שממנו נטענה התוכנה.

Protocol

חבילות התוכנה ששימשו במחקר זה זמינות בחלקן באופן חופשי (ראה טבלת חומרים). 1. רכישת נתונים מרחוק של cryo-ET באמצעות Tomo5 אם התוכנה אינה נטענת, התחל על-ידי הפעלת תוכנה זו ממחשב שרת TEM (ראה טבלת חומרים). בצע בדיקות ראשוניות והגדר את תנאי ההדמיה על-ידי בחירה באפשרות הגדרות קבועות מראש.התחל את הגדרת ההפעלה על-ידי התאמת הפרמטרים של רכישת התמונה בכרטיסייה “הכנה” תחת הגדרות קבועות מראש (איור 2A,B).התאם את “הגדלת הסקירה הכללית” כך שתתאים לגודל ולמינון של ריבוע הרשת כדי לקבל ספירות נאותות.הערה: אם ההגדלה המתאימה אינה ידועה עבור סוג הרשת, חזור לשלב זה לאחר טעינת רשת. “גובה Eucentric” ו “הגדלת חיפוש” יכול להיות זהה. לחץ על חיפוש בכרטיסייה “טומוגרפיה” כדי להגדיר מיקומים ולוודא שההגדלה מספיקה כדי להראות את סימן ההיכר של העניין ולהתאים לאזור “חשיפה” ולאזור “מעקב/מיקוד” בשדה הראייה (איור 2C). הגדר “הגדלת חשיפה” לגודל פיקסל היעד הרצוי. אם הדבר אינו ידוע, קבע זאת על-ידי התאמת ההגדלה לשדה הראייה הרצוי כך שיתאים לאזור העניין. העתק את הפרמטרים של רכישת תמונה (חשיפה) לכל שאר הגדרות ההגדלה הגבוהה (מעקב, סחף, מיקוד, טבעת תון, אפס הפסד,). לשם כך, לחץ על Set כדי להגדיר את “חשיפה” למיקרוסקופ וקבל כדי לקבל את “הגדרות החשיפה” לכל ההגדלות הגבוהות האחרות לאחר בחירתן בנפרד.התאם את זמני החשיפה, במיוחד עבור “פוקוס” ו”מעקב” כדי לתת מספר מתאים של ספירות, גם בהתחשב בעובי של 60°, כלומר גם ב-0° וגם ב-60°, כדי שמספיק אלקטרונים יעברו דרך הדגימה כדי לספק אות חזק לקורלציה צולבת.הערה: כהערכה, זמני החשיפה עבור “מעקב” ו”מיקוד” השווים להגדרה המוגדרת מראש של “חשיפה” הם מדד ראשון טוב. לדוגמה לחישוב מינון עבור ההגדרה המוגדרת מראש “חשיפה”, ראו איור 3. הגדר את זמן החשיפה המחושב עבור ההגדרה המוגדרת מראש “חשיפה” בכרטיסייה “הכנה”. התאם את “ההגדרה המוגדרת מראש של אפס אובדן” כדי להשתמש בגודל ספוט בהיר וגדול יותר (גודל ספוט גדול יותר מתאים למספר קטן יותר), מכיוון שזה דורש מינון גבוה יותר.הערה: קביעה מוגדרת מראש זו משמשת בצורה הטובה ביותר ליישור חריץ מסנן האנרגיה אם הוא קיים במיקרוסקופ. בצע איסוף אטלס לפי השלבים הבאים.כדי לאסוף אטלס, לחץ על הפעלה חדשה בכרטיסייה “אטלס”, הגדר את העדפות ההפעלה, הזן את נתיב האחסון ואת פורמט הפלט ולחץ על החל. בחר סינון (איור 4) ולאחר מכן סמן את כל האטלסים שיש לרכוש. בחר סגור שסתומי Col כדי להשאיר את המיקרוסקופ ללא פיקוח; פעולה זו תסגור את שסתומי העמודה לאחר איסוף כל האטלסים שנבחרו. כדי להתחיל את ההקרנה, לחץ על לחצן התחל . בדוק את האטלסים הבודדים או המרובים לאיתור מטרות על-ידי לחיצה על ה-Grid בחלונית השמאלית תחת “הקרנה” (איור 4), ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור את העכבר כדי לנוע ולגלול באמצע כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה. בחר רשת להגדרת היעד, בחר אותה ולחץ על טען דוגמה מתוך התוכנה. לכיול הזזת התמונה, המשיכו להשתמש בכרטיסיית ההקרנה של האטלס כדי לנווט בתוך הרשת שנטענה. מצאו תכונה ניתנת לזיהוי שתהיה ניתנת לזיהוי בכל הגדרות ההגדלה הקבועות מראש, כלומר גביש קרח החופף לקצה של חור או תכונה מוכרת אחרת (איור 5). עבור לריבוע זה בלחיצת עכבר ימנית, ולאחר מכן “העבר שלב לריבוע רשת”.הערה: הבמה צריכה להיות בגובה יוצנטרי כדי ליישם כיול הזזת תמונה בצורה נכונה. בצע כיול הזזת תמונה.בכרטיסייה “פונקציות אוטומטיות” (איור 6), הגדר את ההגדרה המוגדרת מראש ל”גובה אאוצנטרי”, נווט אל “Auto-Eucentric by Stage Tilt” ולחץ על התחל. עקוב אחר חלון הסטטוס כדי להבטיח שמציאת הגובה האוצנטרי תצליח ולפקוח עין על תמונות ההטיה החיוביות והשליליות; הם חייבים לתאם.הערה: מגרסה 5.8 של תוכנת טומו, ניתן לשנות את הקריטריון לקבלת גובה אאוצנטרי; ברירת המחדל היא 0.25 מיקרומטר, והגדרתה ל-0.5-0.8 מיקרומטר נותנת יותר מרחב תמרון. הערכים תלויים בביצועי המיקרוסקופ, אך מומלץ להם להיות קטנים ככל האפשר.כאשר בגובה יוצנטרי ובפוקוס, מרכז את הבמה על תכונה. אסוף תצוגה מקדימה באמצעות ההגדרה המוגדרת מראש “אטלס”. הגדר את כל “הגדרות קבועות מראש” מהכרטיסייה “הכנה”. לאחר מכן, הגדל את ההגדלה לסקירה כללית > תכונה מרכזית > תצוגה מקדימה, לאחר מכן חזור על “הגדלת חיפוש” ולבסוף, הגדלת חשיפה”. אם התכונה נשארה ממורכזת במהלך המיקוד, דלג על כיול הזזת התמונה. אחרת, כדי לכייל את משמרת התמונה, עברו לכרטיסייה ‘הכנה’, בחרו ‘ כיול משמרת תמונה’ ולחצו על ‘התחל ‘ (איור 5). פעולה זו תתאים באופן איטרטיבי את ההגדלה הנמוכה יותר לתכונה המרוכזת בהגדלת החשיפה.הערה: אם ההגדרה המוגדרת מראש הראשונית “חשיפה” אינה ממורכזת בשלב זה, לצורך מרכוז מחדש, התוכנה תשתמש בהזזת שלב עבור שלב זה בלבד.לחצו על ‘המשך’ כדי לקבל את הקביעה המוגדרת מראש ‘חשיפה ‘ . התמונה הבאה שתוצג תהיה “הגדרת חיפוש מוגדרת מראש”. כדי לכייל את הסטת התמונה בין הקביעות המוגדרות מראש, לחצו לחיצה ימנית כפולה בתצוגה המקדימה של “חיפוש” למקום שבו נמצא מרכז התצוגה המקדימה של “חשיפה”, ולאחר מכן לחצו על ‘רכישה חוזרת ‘ (איור 5). לחצו על ‘המשך ‘ כדי לעבור לזוג הקביעות המוגדרות מראש הבאות.הערה: אם הוחל שינוי תמונה בהגדלה של אטלס במהלך כיול זה, הקפד לרכוש מחדש את האטלס לאחר השלמת כיול הזזת התמונה. בחר את האטלס הרצוי ולחץ על אפס נבחר בחלונית העליונה בכרטיסייה “אטלס”. אשרו והתחילו לרכוש את האטלס הזה שוב. בצע את הגדרת הטומוגרפיה.צור את הגדרת איסוף נתוני הטומוגרפיה בכרטיסייה “טומוגרפיה”.הערה: אלא אם כן צוין במפורש, ההתקנה נעשית במלואה בכרטיסייה “טומוגרפיה”. התחל הפעלה חדשה. ב”הגדרת הפעלה” עבור דגימות ביולוגיות, בחר דמוי לוח כסוג הדגימה ובחר אצווה ומינון נמוך, בחר את פורמט הפלט ותיקיית האחסון, הוסף נמען דואר אלקטרוני ולאחר מכן לחץ על החל.הערה: פריט בתפריט “מיקומי אצווה” הופך כעת לזמין (איור 7A). האטלס הנטען כעת מיובא באופן אוטומטי. “סקירה כללית” ו”חיפוש תמונות” ניתן לרכוש ולבקר מחדש עד לקבלת תמונה חדשה. בנוסף, מגרסה 5.8, ניתן לרכוש מפות חיפוש של אריחים בגודל 3 x 3, 4 x 4 ו- 5 x 5 באמצעות “רכישת מפת חיפוש” כדי להקל על מציאת היעד והגדרתו. הם תואמים גרסה של מונטאז’ים של הגדלה בינונית. כדי להגדיר מטרות, עבור אל “חץ אטלס”, למצוא אזור עניין, ולעבור לשם על ידי בחירת האפשרויות שצצות בלחיצת עכבר ימנית. צלם תמונת סקירה כדי לאשר מיקום טוב לכוונון גובה eucentric, ולאחר מכן לחץ על Auto Eucentric; זה יפעיל את שגרת ההטיה של EUCENTRIC על ידי הבמה. לאחר מכן, רכוש מחדש תמונת סקירה חדשה כדי לעדכן את הגובה האוצנטרי.הערה: אין צורך בלחצן “מיקוד אוטומטי” אם המיקום הוא בגובה יוצנטרי. אם תמונת הגובה האוצנטרית נראית רחוקה מהפוקוס, הגובה האוצנטרי כנראה אינו נכון ויש לבצע אותו מחדש (לפתרון בעיות גובה יוצנטרי, עיין בסעיף הדיון). בדוק את היעד באמצעות ההגדרה המוגדרת מראש “סקירה כללית” לפני הגדרת המיקום הראשון; בחרו בהגדרה המוגדרת מראש ‘סקירה כללית’ והטו את הבמה ל-±60° כדי לבדוק איזה מרחק מסרגלי הרשת ניתן להגדיר את המיקומים (איור 8). בצע זאת על-ידי הזנת ערך זווית ההטיה הרצוי לחלון “הגדר הטיה” (איור 8A). בדוק את הריבוע “סקירה כללית” או את “מפת החיפוש” שנרכשה, עבור לאזור עניין ולחץ על רכוש חיפוש. בדוק את התמונה “חיפוש”. אם אזור העניין אינו ממורכז, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני במיקום הרצוי ולאחר מכן חזור על הזז שלב לכאן ורכוש תמונה. הגדר את Tilt (°) ל- 0.00 (או כל זווית התחלה אחרת שהבמה יכולה לטפל בה) כדי להגדיר את זווית ההתחלה של הטומוגרמה.עבור הטומוגרמה הראשונה, הזן את השם עבור מוסכמת מתן השמות הרצויה לטומוגרמה ואת Defocus כדי להגדיר את ערך ההפחתה הרצוי עבור כל טומוגרמה. לחלופין, מגרסת טומו 5.8 ואילך, ניתן לשנות באופן שיטתי את ערכי ההפחתה בבת אחת; לשם כך, לחץ על בחר מיקומים, בחר את המיקומים שיש לשנות או סמן את סימן הביקורת כדי לבחור את כל העמדות, ולאחר מכן לחץ על עדכן Defocus והתאם את הפרמטרים (איור 7A). התאימו את האזור ‘מיקוד’ ו’מעקב’ (איור 2C). לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לגרור את אזורי המעקב והמיקוד (עיגולים צהובים וכחולים). ודא שאזור המעקב/מיקוד נמצא (בעיקר) בפחמן או בתכונת מעקב מתאימה אחרת, כלומר תכונה דומה לאזור העניין; הימנע סדקים, זיהום קרח, אזורים עבים מדי וחורים ריקים.בעת בחירת פחמן ריק ללא תכונות מעקב רבות, ודא שהאזור מתחיל להישרף באמצע הטומוגרמה על ידי בחירת מינון גבוה מספיק למיקוד, ומעקב כדי לשרוף לאט את הדגימה בהטיה גבוהה יותר. זה יכול להיות מועיל כדי לשמור על דיוק המעקב. ודא שאזור המעקב/המיקוד אינו חושף אזור רכישה מאוחר יותר.הערה: היזהר ממה קרוב ומה ייכנס לקורה. הימנע מאזורים עם תכונות שיתערבו במעקב ו/או בחשיפה, כולל פסי רשת. לחץ על הוסף מיקום לאחר הגדרת כל הפרמטרים והגדרת אזור העניין הרצוי ו”מיקוד “ו”מעקב “. חזור על הפעולה לקבלת יעדים חדשים.הערה: כדי לבדוק שהגובה האוצנטרי מכויל כהלכה עבור מיקומי האצווה שהוגדרו, קיימות מספר אסטרטגיות זמינות. מומלץ לבחור אחד על סמך סוג הטומוגרפיה המבוצעת (מולקולרית, סלולרית, למלה). עבור טומוגרפיה מולקולרית, בהנחה שהרשתות שטוחות למדי וגובה אאוצנטרי נעשה במרכז כל ריבוע המכיל מיקומי מטרה, דלג על הליך “עידון הכל” (או עידון נבחר אם נבחרו מיקומים, איור 7A). אם טומו מתקשה עם שגרת ההטיה האוטו-אוצנטרית לפי הבמה, אולי תלחצו על דלג על יוצנטרי.עבור דגימות סלולר או למלה, כל מיקום אצווה עשוי להיות בגובה z שונה. השתמש ב”עידון הכל” כדי להיות זהיר או אל תסמן את האפשרות “דלג על Eucentric”.הערה: “מקד הכל” יחזור על כל הטומוגרמות שהוגדרו או נבחרו באמצעות “בחר מיקומים”; מקד את הגובה האוצנטרי ובצע מעקב ומיקוד לפני רכישת נתונים. הליך זה יכול לחשוף כל חשיפה חופפת מאזור המיקוד/מעקב הבא של טומוגרמה (איור 7B), שיש לקחת בחשבון לפני שתמשיך. בדוק ובדוק שוב את הריבועים שכשלו בעידון שלהם. באמצעות לחצן העכבר הימני, לחץ על המיקום שנכשל כדי לראות אפשרויות. אם הגובה האוצנטרי נכשל, מצא “Auto-eucentric by stage-tip” (שלב 1.4.1.), רכוש תמונת “חיפוש” חדשה כדי לעדכן את גובה z, ו”הוסף מיקום”. מחק את המיקום שנכשל/אותחל בעבר. לחץ על האפשרות דלג על Eucentric , אשר נעשה עם “לחדד הכל”.הערה: אם האפשרות “עידון הכל” אינה מופעלת, אין לבדוק את האפשרות “דלג על Eucentric”. Tomo5 יפעיל עידון יוצנטרי לפני כל טומוגרמה נרכשת; בדרך זו, עמדות שנכשלות בעידון יוצנטרי ידלגו. בצע פונקציות אוטומטיות בהתאם לשלבים הבאים.בדוק את ההגדרות לביצוע היישורים באמצעות הכרטיסייה “פונקציות אוטומטיות” על ידי ניווט באטלס לאזור של פחמן. הביאו את האזור הזה לגובה יוצנטרי ועקבו אחר סדר היישורים כאמור להלן.הפעל את Auto-eucentric לפי הטיית שלב עם הגדרה קבועה מראש של “גובה אאוצנטרי”. הפעל את שגרת המיקוד האוטומטי עם ההגדרה המוגדרת מראש “מיקוד”. הפעל את שגרת Autostigmate עם ההגדרה המוגדרת מראש “טבעת תון”. הפעל את שגרת אוטוקומה עם ההגדרה המוגדרת מראש “טבעת תון”. הכנס את הצמצם האובייקטיבי הרצוי (איור 6B), ככל הנראה מפתח צמצם של 100 מיקרומטר, כפשרה טובה לניגודיות דגימה מוגברת ורק חתך קטן באות ברזולוציה גבוהה מאוד. חזור על שגרת Autostigmate לאחר הכנסת הצמצם.הערה: בהגדלה עם גדלי פיקסלים סביב 3 Å ורזולוציות נמוכות יותר, שגרת Autocoma עלולה להיכשל; במקרה זה, בדוק ויישר את מרכז הסיבוב של Tomo תחת יישורים ישירים בממשק המשתמש של TEM. בדוק ששגרת המרכוז האוטומטית של אפס אובדן פועלת על המדגם שלך. עם ההגדרה הקבועה מראש של “Zero Loss” במינון גבוה למדי (שלב 1.2.3), סביר יותר שהשגרה בפונקציות אוטומטיות תצליח. בצע איסוף נתונים.כדי להתחיל את הרכישה האוטומטית בכרטיסייה “טומוגרפיה”, בחר את לוח רכישת הנתונים והגדר את הפרמטרים הרצויים (איור 7C). הגדרת פרמטרים לאיסוף נתונים: שלב הטיה (°), זווית חיובית מרבית (°), זווית שלילית מרבית (°), ערכת מעקב (מומלץ: בחר מעקב/מיקוד לפני רכישה). בחר סגור שסתומי עמודים עבור ערכת גובה eucentric.הערה: פרמטרים הנמצאים בשימוש לעתים רחוקות הם “התאם את זמן החשיפה”, “התאם ZLP”, “השתמש בלוח פאזה” ו”השהה לאחר הטיה”.השתמש בכוונן את זמן החשיפה עבור טומוגרמות שאינן מיועדות ל-STA כדי להגדיל את זמן החשיפה ביחס מוגדר בהטיות גבוהות יותר. האפשרות התאם ZLP תפעיל חידוד ZLP לאחר כל טומוגרמה, ללא קשר לערכת המחזוריות. היא איטית, נכשלת מדי פעם ללא סיבות ברורות, ותדלג על רכישת הפוזיציה. עם זאת, זה יכול להיות שימושי עבור רוחב חריץ צר מאוד, כלומר, 3-5 eV על מסנן Selectris(X). השתמש בלוח פאזה משמש לעתים רחוקות מאז כניסתם של DEDs עם מסנני אנרגיה. התכונה ‘השהה לאחר הטיה’ אמנם משהה את הרכישה , אך אינה מאפשרת שינויים כלשהם בתוכנה. בדוק שוב את הפרמטרים לאיסוף נתונים (בכרטיסייה “הכנה”), מסכים עם חישוב המינון וערכת ההטיה הרצויה, ציין את מספר השברים (אנ’) בהגדרה המוגדרת מראש “חשיפה” ולאחר מכן התחל ברכישה.הערה: מספר השברים תלוי במדגם, בפרמטרים של הרכישה ובשלבי העיבוד המתוכננים, כלומר STA לעומת ניתוח מורפולוגי, ויש לשמור אותו לערכים שבהם תיקון תנועה והערכת CTF מקבלים מספיק אות. טווח של 4-10 שברים הוא הערכה טובה, כאשר 4 מתאים יותר לדגימות עבות יותר ו -10 לדגימות מולקולריות דקות יותר.לאחר מכן, לחץ על התחל כדי להתחיל באיסוף הנתונים ולפקח על רכישת הטומוגרמה הראשונה כדי לוודא שהטומוגרמות נרכשות כמתוכנן.הערה: לגרסאות תוכנת הטומוגרפיה האחרונות יש לוח נוסף של נגן הסרטים בכרטיסייה “טומוגרפיה”, שם ניתן לצפות בטומוגרמות שנרכשו. היו סבלניים במהלך תהליך ההעמסה. 2. Cryo-ET STA של אפופריטין באמצעות emClarity הערה: כאן, תוכנת emClarity17 משמשת להמחשת קביעת מבנה cryo-ET על ידי STA. איור 9 מסכם תהליך זה. שש סדרות הטיה של אפופריטין (EMPIAR-10787) נלקחו כדוגמה. הסימטריה האוקטהדרלית הופעלה, ולמפה הסופית הייתה רזולוציה של 2.86 Å, שהתקבלה מ-4,800 חלקיקים בלבד וקרובה לתדר ניקוויסט (2.68 Å). ודא שחבילת התוכנה emClarity39 הורדה והותקנה (ראה טבלת חומרים). התקן את IMOD לעיבוד התוכנה40.הערה: נדרש ידע בסיסי בפקודות Linux. מדריך מפורט יותר ניתן למצוא בהפניה41, אשר לוקח מערך נתונים ריבוזום (EMPIAR-10304) כדוגמה ומתאר את ההליכים שלב אחר שלב. עבור סוגים שונים של דגימות חלבון, דוח שפורסם בעבר זמין גם42. הכן את קבצי הקלט והספריות.הערה: המסגרות הגולמיות תוקנו בתנועה על-ידי MotionCor2 (תיקון 5 x 5)43 (ראה טבלת חומרים). התמונות שתוקנו בתנועה נערמו כדי ליצור את סדרת ההטיה באמצעות newstack (IMOD) ויושרו ידנית עם מעקב אחר טלאים באמצעות Etomo (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן emClarity. כדי לקבל יישורים טובים יותר, מומלץ לבצע קיזוזים ופיצוי הטיה באטומו. שש סדרות ההטיה נקראות TS1 ל-TS6. להלן ההוראות והפקודות עבור סדרת ההטיה הראשונה (TS1) כדוגמה.יצירת תיקיית פרוייקט.הערה: הגרסה העדכנית ביותר של התוכנה היא 1.5.3.11. ניתן למצוא את כל יומני התוכנה הקשורים בתיקיית הפרויקט המקומית (…/logFile/emClarity.logfile). תחת תיקיית הפרוייקט, צור תיקיה חדשה נוספת, “fixedStacks”, והכן את קבצי הקלט: TS1.fixed, TS1.xf ו- TS1.tlt.הערה: TS1.fixed: סדרת ההטיה המקורית, הידועה גם בשם TS1.st באטומו. TS1.xf: קובץ זה מכיל את קואורדינטות ההמרה לאחר Etomo tiltalign. TS1.tlt: קובץ זה מכיל זוויות הטיה. הערך את ההפחתה בהתאם לשלבים הבאים.חשב את הדה-פוקוס. עדכן את קובץ הפרמטרים במיקרוסקופ ובפרמטרים של ההדמיה בהתאם לטבלה משלימה 1. העתק קובץ פרמטר לתיקיית הפרוייקט, שנה את שמו ל- param_ctf.m והפעל: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.הערה: ניתן למצוא את תבנית קובץ הפרמטרים בקובץ המשלים 1 או בספריית התקנת התוכנה המקומית (…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/). בדוק את תוצאות הערכת ה- CTF עבור כל ערימה.בדוק את הערימות המיושרות (לדוגמה, aliStacks/TS1_ali1.fixed) באמצעות 3dmod וודא שהחרוזים הפידוקיאליים נמחקים כהלכה. ודא שקובץ היומן מדווח שהיד נכונה, וניתן למצוא אותה ב- logfile/emClarity.logfile (איור 9). בדוק את ערך ההפחתה (לדוגמה, fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf), וודא שהוא תואם לאומדן CTF התיאורטי. הגדר את אזורי המשנה.צור טומוגרמה מחוברת. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: sh recScript2.sh -1.הערה: טומוגרמה קטנה יותר (בגודלה) עבור כל ערימה תאוחסן בתיקייה חדשה “bin10”. כדי להאיץ את התהליך, ניתן להגדיר את הקואורדינטות של אזור משנה אחד או יותר בטומוגרמה bin10. קובץ הסקריפט יהיה בספריית התקנת התוכנה המקומית (…/emClarity_1.5.3.11/docs/). קבע את הגבולות על-ידי בחירת שש נקודות, x min, x max,y min, ymax, zmin ו- zmax, כדי ליצור תת-אזור אחד. תחת התיקייה “bin10”, הפעלה: 3dmod TS1_bin10.rec.הערה: אם ברצונך ליצור ארבעה אזורי משנה בסדרת הטיה אחת, בחר 6 × 4 = 24 נקודות. כל מחסנית חייבת לכלול קובץ דגם אחד (*.mod) תחת התיקייה “bin10”. המר את קבצי המודל לתבנית emClarity. פעולה זו תיצור שחזור תיקיה חדש. אחסן את כל הקואורדינטות של כל אזור משנה תחת תיקיה זו. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: sh recScript2.sh TS1. לקטוף חלקיקים.מצא תבנית אפופריטין לקטיף חלקיקים. הורד תבנית מבנק הנתונים של מיקרוסקופיית אלקטרונים (EMD-10101)44. ודא שגודל הפיקסלים של התבנית תואם לזה של הנתונים הגולמיים. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity לשנות את קנה המידה של ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 מעבד. צור טומוגרמות מתוקנות CTF לקטיפת חלקיקים. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity ctf 3d param_ts.m תבניתחיפוש. הפעל בחירת חלקיקים עבור כל תת-אזור. עבור מערך הנתונים של אפופריטין, בצע חיפוש תבנית ב- bin6. שנה את הפרמטרים Tmp_angleSearch (θ out, Δout, θ in, Δin) כדי לקבוע את טווח הזווית והמרווחים לחיפוש במישור או מחוץ למישור במעלות. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.הערה: תיקייה “convmap_wedge_Type2_bin6” תיווצר בשלב זה. קובץ ה- csv תחת תיקיה זו (לדוגמה, TS1_1_bin6.csv) כולל את כל המידע על החלקיקים שנבחרו. הסר את החלקיקים השגויים באמצעות 3dmod. תחת התיקיה “convmap_wedge_Type2_bin6”, הפעלה: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.הערה: זה נפוץ למצוא חלקיקים שגויים ליד קצוות פחמן או זיהום קרח באזורים אלה. בצע לחיצת עכבר ימנית על הנקודות השגויות ולחץ על backspace במקלדת כדי למחוק אותן. בשלב זה, ודא שרוב הנקודות החיוביות המוטעות יוסרו (איור 10). שנה את שם התיקיה “convmap_wedge_Type2_bin6” ל- “convmap”, מכיוון ש- emClarity ילך וימצא מידע על אזור משנה תחת convmap בשלבים הבאים. אתחל את הפרויקט. בתיקיית הפרויקט, הפעל: emClarity init param0.m, כדי ליצור מסד נתונים עבור emClarity, ApoF.mat. בצע שחזור טומוגרמות לפני STA ויישור. כדי ליצור טומוגרמות תת-אזור מתוקנות CTF ב- bin4, הפעל: emClarity ctf 3d param0.m.הערה: טומוגרמות מתוקנות CTF (לדוגמה, cache/TS1_1_bin4.rec)  ייווצרו בתיקיה חדשה “מטמון”. ביצוע STA ויישור.בצע את הממוצע באמצעות תת-טומוגרמות מתוקנות CTF החל מ- bin4. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment. המשך לבצע יישורים ולהפעיל: emClarity alignRaw param0.m 0.הערה: שלב הממוצע יוצר הפניה, אשר תשמש את emClarity בשלב זה כדי ליישר את החלקיקים. ניתן לשנות את הפרמטרים Raw_angleSearch (θ out, Δout, θ in, Δin) כדי להגדיר את טווח הזווית וגדלי הצעדים עבור כל מחזור. מכיוון שרוב החלקיקים השגויים מוסרים ממסד הנתונים (שלב 2.6.4), הגדרות זוויתיות אלה ליישור יכולות להתחיל במידה קטנה יחסית. עדכן את הפרמטרים Raw_angleSearch והפעל עוד כמה מחזורים (שלבים 2.9.1 ו- 2.9.2). כדי להאיץ את התהליך, בצע יישורים בתוך המישור ומחוץ למישור בנפרד.הערה: עבור כל binning, מומלץ להפעיל מחזורים מרובים ולהפחית בהדרגה את ההגדרות הזוויתיות. עבור מערך הנתונים של ApoF, בוצעו חמישה מחזורים נוספים בסל 4, ופרטים נוספים זמינים בטבלה משלימה 2. עבור cycle001, בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, ואחריו emClarity alignRaw param1.m 1. נקו את החלקיקים החופפים. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity removeDuplicates param5.m 5. בצע חידוד מסדרת Tilt עם tomoCPR.הערה: שלב זה הוא אופציונלי.הפעל את tomoCPR כדי לחדד את גיאומטריית המחסנית. בתיקיית הפרויקט, הפעל: emClarity tomoCPR param5.m 5. צור אוספים מיושרים חדשים ועדכן את קובצי הגיאומטריה. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity ctf update param6.m.הערה: ודא שקובצי הגיאומטריה החדשים (לדוגמה, fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) והאוספים החדשים המיושרים (לדוגמה, aliStacks/TS1_ali2.fixed) נוצרו כהלכה. צור תת-טומוגרמות חדשות ב- bin2. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity ctf 3d param6.m.הערה: לאחר מכן יתקיימו מספר מחזורים לממוצע ויישור ב- bin2 (שלבים 2.9.1, 2.9.2 ו- 2.9.3), ניקוי כפול (שלב 2.9.4) ו- tomoCPR אופציונלי (שלב 2.10). בשל סימטריה גבוהה, חמישה מחזורים נוספים ב- bin2 בוצעו עבור אפופריטין. עדכן את הפרמטרים Raw_angleSearch עבור כל מחזור. בצע שחזור סופי.המשך להפעיל מספר מחזורים ב- bin1 וב- tomoCPR (שלב 2.9 ושלב 2.10). עוד 10 מחזורים נוספים ב-bin1 בוצעו עבור מערך הנתונים של אפופריטין. פרטים נוספים לגבי הפקודות והפרמטרים ניתן למצוא בטבלה 2. בצע שחזור סופי על-ידי שילוב שני מערכי הנתונים למחצה. בתיקיית הפרוייקט, הפעל: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, ואחריו emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.הערה: המפה הסופית (לדוגמה, עם גורם B של 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) תיווצר, איור 11.

Representative Results

עבור דגימות תאיות ודגימות לאמלה, אסטרטגיית איסוף הנתונים תלויה במידה רבה בדגימה ובמטרה של מחקר ההדמיה (איור 1). גישת המיקוד תלויה בשאלה אם המטרה המולקולרית נמצאת באתרה או מוכנה מהקומפלקס המקרומולקולרי המטוהר עבור דגימות שחזור ברזולוציה גבוהה המכילות מטרות מולקולריות. עבור קומפלקסים מטוהרים המוגדלים על גבי רשתות חוריות (פחמן), המיקוד יכול להתבסס פשוט על הדמיה בחורים של סרט התמיכה (פחמן). עבור עבודה באתרה , גישת המיקוד דורשת ידע על מיקום הישות המולקולרית בהתבסס על נתונים קורלטיביים או ציוני דרך תאיים ידועים בהגדלה נמוכה. ציוני דרך סלולריים יהיו ניתנים לזיהוי באופן אידיאלי בעת צילום תמונות סקירה, ואם מספיק למקם באופן גס אזורי עניין, הם יכולים לספק דרך מהירה לאשר את זהות היעד באמצעות תמונת חיפוש. עם זאת, אם האירועים הנצפים נדירים, ייתכן שיהיה צורך בתמונות חיפוש בהגדלה בינונית כדי להכשיר את היעד נכון. מפות חיפוש הן מונטאז’ים של הגדלה בינונית של תמונות חיפוש ויכולות, לפיכך, להפוך את מציאת המטרה לקלה הרבה יותר, שם ניתן לרכוש אותן בהגדלה שבה התכונה המעניינת גלויה. לאחר מכן ניתן לסנן מפות חיפוש כדי למצוא ולהגדיר מיקומי אצווה של יעדים. עבור דגימות המכילות תכונות תאיות לשחזור אולטרה-סטרוקטורלי, גישת המיקוד דומה, אם כי תלויה באותה מידה בנראות של האירוע התאי בהגדלות שונות ובשכיחותו בדגימה. יש לקחת בחשבון גם את אסטרטגיית רכישת הנתונים; בכל המקרים, מטרת המחקר קובעת במידה רבה כיצד הנתונים נאספים. עבור שחזור של האולטרה-מבנה התאי, הגדלה נמוכה (20-5 Å/px) ושדה ראייה גדול עשויים להיות מתאימים, אך יש צורך בהגדלה גבוהה כדי לשחזר פרטים מולקולריים או ברזולוציה גבוהה (5-1 Å/px). מערך נתונים שנאסף ב-1.5 Å/px בתנאים אידיאליים יוכל לייצר שחזור בתדר Nyquist של 3.0 Å/px; עם זאת, במציאות, גורמים רבים, כולל אך לא מוגבל לעובי הדגימה, גודל וההטרוגניות, כולם משפיעים על איכות השחזור המתקבלת. פרמטרי ההדמיה המדויקים מאזנים גם את ההגדלה בהתבסס על מטרת המחקר עם שדה הראייה כדי להכיל מספיק מידע. מאמר זה מציג מקרה ממוצע של תת-טומוגרמה המגיע ל-2.86 Å, אך מחקרים נוספים 17,42,43,44,45 מוצגים בטבלה 1 כדי להמחיש את פרמטרי האיסוף הקשורים למחקרים המכוונים לתוצאות שונות17,42,45,46. לאחר יצירת זרימת עבודה ממוקדת ומשטר רכישת נתונים עבור cryo-ET, איסוף נתונים של סוגי דגימות רבים ושונים אפשרי. טומוגרמות מייצגות של מגוון דגימות מוצגות כאן: דגימות מולקולריות כגון אפופריטין (סרט 1), תהליכים תאיים דקים (סרט 2), ולמלה טחונה FIB של דגימת התא העבה (סרט 3). איור 1: מבט כולל על הגדרת זרימת העבודה של טומוגרפיה. זרימת העבודה של הדמיית cryo-ET המתוארת בפרוטוקול מוצגת כתרשים זרימה. התמונות הצפויות להירכש מוצגות עבור זרימת העבודה התאית והמולקולרית. השם המוצג תואם את מוסכמת Tomo5, אם כי רוב תוכנות רכישת הטומוגרפיה חולקות עקרונות משותפים לאיסוף תמונות אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: כרטיסיית הכנה ותנאים מוגדרים מראש לחיפוש . (A) תמונת סקירה של הכרטיסייה כולה. קביעות מוגדרות מראש של תנאי הדמיה מוגדרות בכרטיסייה זו, וניתן למצוא את “כיול Image Shift” ו-“הגדרות מסנן תמונות” ברשימה הנפתחת “משימות”. (B) התקרבות של התפריט הנפתח “הגדרות קבועות מראש” שבו ניתן לבחור כל קביעה מוגדרת מראש להגדרת תנאי הדמיה נפרדים. (C) תמונה המתארת הגדלה מתאימה כדי להתאים הן את החשיפה והן את אזור “מיקוד ומעקב” לשדה הראייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: חישובי מינון. חישובי מינון לדוגמה עבור תוכניות רכישת טומוגרמה אפשריות שבהן שיעור המינון נמדד על פני ואקום. שני החישובים קובעים את זמן החשיפה (ים) עבור כל הטיה, בין אם מדובר במינון אופטימלי לכל הטיה או במינון כולל אופטימלי עבור סדרת ההטיה המלאה. בממוצע תת-טומוגרמה, מקובל להתמקד במינון אופטימלי לכל תמונה מוטה בטווח של 3.0-3.5 e-/Å2. בשני המקרים, ה-“Fractions (Nr.)” מוגדרים ל-6 כדי להשיג ~0.5 e-/Å2 של מינון לכל מסגרת סרט של ההטיה לקבלת אות מספיק לביצוע תיקון תנועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: כרטיסיית אטלס. תמונת סקירה כללית של הכרטיסייה “אטלס”. התמונה נחתכה כדי להימנע ממרחבי מיקום ריקים ברשת. תפריט “משימות” מכיל העדפות הגדרת הפעלה ומרחבי בחירת רשת לבחירה פרטנית של כל הרשתות שהומצאו ואפשרות לרכוש אטלס יחיד לאחר הסרת הקלטת מהמטען האוטומטי. ניתן לאפס רשת שנבחרה ולאחר מכן לרכוש אותה מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: שינויי תמונה מכוילים. התמונה מתארת תמונת חשיפה וחיפוש. הצלב האדום בתמונת החיפוש הוא הסמן שהוזז כדי לתקן את ההסטה בין החשיפה לחיפוש. יש לבצע מחדש כיול הזזת תמונה בתחילת ההפעלה או לאחר שינוי הגדרות מצב ההדמיה המוגדרות מראש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: פונקציות ומפתחי צמצם אוטומטיים. (A) הכרטיסייה “פונקציות אוטומטיות” מתארת את הרשימה הנפתחת “הגדרות קבועות מראש” ואת הבחירה “משימה”. קו תחתון בכחול הוא ההגדרה המוגדרת מראש “טבעת תון” הנדרשת עבור “Autostigmate” (גם הוא מסומן בקו תחתון בכחול) ו-“Autocoma”. יש לבחור הגדרות קבועות מראש מתאימות עבור כל משימה ולאחר מכן ללחוץ על לחצן התחל . (B) פתחים נמצאים בממשק המשתמש של TEM. בחר את “מפתח הצמצם האובייקטיבי” הרצוי לאחר ביצוע הפונקציות האוטומטיות והפעל את “Autostigmate” עם הצמצם פנימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: סקירה כללית של כרטיסיית טומוגרפיה. תמונות מציגות את ממשק המשתמש של Tomo 5.8. (A) מיקומי אצווה. הפונקציות האחרונות המתוארות בתמונה: האפשרות “רכישת מפת חיפוש”; מיקומי טומוגרמה מוצגים בתצוגת אטלס עם אפשרות זום-אין; מודגש בפינה השמאלית העליונה הוא “בחר עמדות”; מתחת לכל ארבעת המיקומים נבחרו לפרמטרים “עדכון Defocus”. (B) שלושה מיקומים נבחרים במפת החיפוש, המסומנים 1, 2 ו-3. מיקום 1 לא יהווה בעיה כאשר “עידון הכל” מופעל. עם זאת, אם בהגדרת צפיפות יעד גבוהה, כגון כאשר נבחרים מיקומי lamellae, כפי שמתואר עבור מיקום 2 ומיקום 3, אז “עידון הכל” יפעיל את שגרת “מעקב” ו”מיקוד” על אזור “חשיפה” של מיקום 2, ויחשוף את המטרה לפני רכישת הטומוגרמה. סוג הרשת הוא R1.2/1.3. סרגל קנה מידה = 1.2 μm. (C) רכישת נתונים. כעת ניתן לרכוש בנפרד את הגדרת המיקומים שנבחרו ב”מיקומי אצווה”. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 8: הגדרת זווית ההטיה המרבית. האיור מתאר גישה שלב אחר שלב לקביעת טווח ההטיה המרבי לרכישת טומוגרמה. (A) סקירה כללית של 0° ומפת חיפוש במרכז ריבוע הרשת. כדי לבדוק את טווח ההטיה, ניתן להגדיר את הזווית בתוכנת הטומוגרפיה עם “הגדר הטיה (°)” על ידי הקלדת הערך הרצוי ולאחר מכן לחיצה על Set. (B) השלב הוטה ל-−60°, מה שמראה שפינה של מפת החיפוש לא תירכש במלואה ב-−60°. (C) השלב הוטה ל-60°. על ידי ספירת החורים שנעלמו בטמפרטורה של ±60°, ניתן לקבל מושג על טווח ההטיה של ריבוע רשת. סרגלי קנה מידה = 2.5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 9: תרשים זרימה של emClarity. תרשים הזרימה תיאר את השלבים השונים לממוצע תת-טומוגרמה של קריו. פסי קנה מידה = 50 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 10: התאמת תבניות באמצעות emClarity . (A) מיקרוגרף טיפוסי של אפופריטין על גבי רשת מצופה גרפן. Defocus: −3.430 μm. (B) פרוסה של טומוגרמה מכוסה בנקודות מודל לאחר חיפוש בתבנית. (C) מבט עליון ו-(D) תצפית הקרנה צדדית של נקודות מודל, המציין שכבה שטוחה אחת של חלקיקי אפופריטין חד-ממדיים. פסי קנה מידה = 50 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 11: Cryo-ET STA של אפופריטין . (A) המפה הסופית לאחר 21 מחזורים של יישור תת-טומוגרמה. (B) מתווה מתאם מעטפת פורייה (FSC) של המפה הסופית עם רזולוציה מדווחת של 2.86 Å, המכילה 38 קונוסים FSCs. (C) מפות צפיפות מייצגות (מצוידות בדגם PDB 6s6147). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. לדוגמה סוג Cryo-ET Å/px טווח הטיה (+/-) שלב הטיה (°) טווח הפחתה (μm) מינון כולל (e-/Å2) רזולוציה נתונים גולמיים הפניה אפופריטין מטוהר/מולקולרי (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 אמפיאר-10787 17 ומאמר זה HIV-1 Gag מטוהר/מולקולרי (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17 ריבוזום מטוהר/מולקולרי (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 אמפיאר-10304 42 ספייק של SARS-CoV-2 למלה/מולקולרית (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 אמפיאר-10753 45 מבנה האקסון של הנוירונים תאי (אולטרה-סטרוקטורלי) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 נ.ד. אמפיאר-10922 47 טבלה 1: פרמטרי איסוף עבור מספר מחקרי cryo-ET. מחקרים שמטרתם שחזור של פרטים מולקולריים מחלבונים מטוהרים או in situ בהשוואה למחקר שמטרתו לפתור ולפלח את התכונות התאיות האולטרה-סטרוקטורליות. סרט 1: טומוגרמה של דגימות אפופריטין ברשת EM רגילה ולאחר מכן תמונה עם cryo-TEM מצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה במיוחד עם מסנן תואם. סדרת ההטיה נרכשה בסכמת מינון-סימטרית, עם טווח הטיה של 54° ומינון כולל של 134 e-/A2 בתוכנת טומוגרפיה אלקטרונית. סרגל קנה מידה = 50 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 2: טומוגרמה של תא עצב ראשוני שגדל על רשת EM ולאחר מכן צולם ישירות באמצעות cryo-TEM המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה במיוחד עם מסנן תואם. סדרת ההטיה נרכשה בסכמת מינון-סימטרית, עם טווח הטיה של 60° ומינון כולל של 120 e-/A2 בתוכנת טומוגרפיה אלקטרונית. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 3: טומוגרמה של ציאנובקטריה ברשת EM, נתונה לכרסום FIB ולאחר מכן מצולמת עם cryo-TEM המצויד במצלמה במהירות גבוהה ומסנן תואם. סדרת ההטיה נרכשה בסכמת מינון-סימטרית, עם טווח הטיה של 50° ומינון כולל של 120 e-/A2 בתוכנת טומוגרפיה אלקטרונית. סרגל קנה מידה = 87.2 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. קובץ משלים 1: תבנית קובץ הפרמטרים להערכת ה- defocus. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. טבלה משלימה 1: איסוף נתונים ופרטי הגדרת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 2: רשימת פקודות לפי סדר הביצוע. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

טומו5
תיאור זרימת העבודה של תוכנת הטומוגרפיה מדגיש דרך פוטנציאלית אחת ויעילה ביותר להגדרת הפעלת טומוגרפיה אצווה (מרוחקת). בעוד התוכנה קלה למתחילים, כמה ניסיון קריו-EM ראשוני והבנה טומוגרפיה בסיסית יכולים לעזור עם ההתקנה. שלבים קריטיים מסומנים בפרוטוקול ואמורים לסייע בפתרון בעיות גם אם נעשה שימוש בגישת התקנה שונה. התקדמות התוכנה תקל על איסוף נתונים (מרחוק) ותהפוך את cryo-ET לנגיש יותר לבסיס משתמשים רחב. כמה עצות וטריקים שיכולים לסייע בפתרון בעיות נפוצות מתוארים להלן.

נקודה חשובה אחת שיש לדון בה היא בחירת הרשתות, מאחר שכאשר מטים את הדגימה ל-±60°, פסי רשת בהטיה גבוהה יכולים לטשטש את התצוגה (איור 8). ברשת TEM, גודל רשת השינוי מתייחס למספר ריבועי הרשת ליחידת אורך של הרשת. למספרי רשת שינוי גדולים יותר יש יותר ריבועי רשת ליחידת אורך, צפיפות גבוהה יותר של ריבועי רשת וריבועי רשת קטנים יותר, כלומר, לרשת של 400 רשתות שינוי יש ריבועים קטנים יותר מרשת שינוי של 200 רשת. בחירה טובה של רשתות עבור טומוגרפיה היא 200-רשת או 300-רשתות שינוי. כפי שניתן לראות באיור 8, השטח הזמין לאיסוף מצטמצם ככל שהרשת מוטה. בהטיה של ±60°, לרשת של 300 רשת יהיה שדה ראייה קטן שעליו ניתן לרכוש טומוגרמה מלאה. היתרונות של רשתות של 200 רשתות הם שריבועי הרשת הגדולים יותר הופכים את מערך הטומוגרפיה המולקולרית למהיר יותר, ועם הגדלת שטח הרשת-ריבוע, סביר להניח שריבוע אחד יספיק לאיסוף בן לילה. החיסרון הוא שרשתות של 200 רשתות הן שבריריות יותר, ולכן טיפול וחיתוך דורשים יותר עדינות.

יתר על כן, אם משתמשים בסרט תמיכה חורי (ראה טבלת חומרים) ברשתות EM, יש לשקול את מרווח החורים לצורך הגדרת אזור המיקוד והמעקב ביחס לאזור החשיפה. באופן אידיאלי, קוטר הקרן בהגדלה הרצויה צריך להיות קטן מספיק כדי לכסות את שטח הפחמן הסמוך לאזור החשיפה לאורך ציר ההטיה להגדרה אופטימלית ומהירה. בדרך זו, ניתן לרכוש אזורי עניין פוטנציאליים בכל חור.

מכיוון ששגרת הגובה האוצנטרית של התוכנה אינה חזקה כרגע, כגון שגרת SerialEM, העצות הבאות יכולות לעקוף בעיה זו. אם קביעת הגובה האוצנטרי נכשלת באמצעות הגדרת הגובה האוצנטרית המוגדרת מראש, ניתן להשתמש במקום זאת בקביעה המוגדרת מראש של הסקירה ולהפעיל מחדש את “Auto-eucentric by stage tilt”; זה יכול לפתור בעיות אם הגובה האוצנטרי רחוק מ-0. אם זה יצליח, אפשר להריץ מחדש את “Auto-eucentric by stage tilt” עם הגדרות קבועות מראש של “גובה אאוצנטרי” כדי לשפר את הדיוק. אם זה נכשל, ניתן להריץ “Auto-Eucentric על ידי הטיית קרן” עם הגובה eucentric preset ולאחר מכן להפעיל מחדש “Auto-Eucentric על ידי הטיה שלב” או להגדיר באופן ידני את גובה z מאוחד על ידי “Auto-Eucentric על ידי הטיית קרן” בממשק המשתמש TEM תחת הגדרות “שלב”. במקרה שנעשה שימוש ברשתות עם תבנית חוזרת של חורים, הן עשויות למנוע זיהוי של שיא מתאם צולב יחיד. אפשר לנסות לשנות את הגובה האוצנטרי שנקבע מראש להיסט defocus נמוך יותר כגון −25 מיקרומטר ו/או זמן חשיפה קצר יותר כדי להפחית את המתאם הצולב מתבניות החורים. מצד שני, שימוש ברשתות שרוכים/לאמלה עשוי שלא לספק איתות מספיק לשיא קורלציה צולבת חזקה. אפשר לנסות לשנות את הגובה האוצנטרי שנקבע מראש להיסט הפחתה גדול יותר כגון −75 מיקרומטר ו/או זמן חשיפה ממושך כדי לשפר את שיא המתאם הצולב. אפשרות נוספת היא להתאים את הגדרות מסנן התמונה; הם יכולים להימצא בכרטיסייה “הכנה”. ניתן להגדיר אפשרויות להתאמת קביעות המסנן לערך נמוך (סקירה כללית/Gridsquare), בינוני (גובה Eucentric) והגדלה גבוהה (מעקב/מיקוד) כדי למצוא את שיא המתאם הצולב האופטימלי עבור כל קביעה מוגדרת מראש. הקלט הנדרש הוא תמונה אחת, כלומר ב- 0° ואחת ב- 5°, ולאחר מכן לחיצה על השווה כדי להשוות בין שתי התמונות . הערך ההתחלתי המומלץ עבור אורך הגל הארוך ביותר הוא רבע מסרגל קנה המידה בתמונה ואורך הגל הקצר ביותר הוא רבע מסרגל קנה המידה. אם השיא אינו מזוהה היטב, ניתן לייעל את ההגדרות עד למציאת שיא משכנע. אין צורך לרכוש מחדש תמונות בכל פעם; פשוט לחיצה על “השווה” מספיק. אם TOMO עדיין לא מצליח למצוא באופן אוטומטי את הגובה האאוצנטרי, ניתן להשתמש בכיול הגובה האאוצנטרי הידני. יש להתרכז מעל גביש קרח גדול למדי בהגדלה כללית בכרטיסייה “הכנה”, ואז לעבור ל”בקרת הבמה “של ממשק המשתמש של TEM, להגדיר אלפא ל-−30°, ולהתאים את ערך ה-z של השלב כדי למרכז מחדש את הגביש באמצעות תמונת המסך הפלואורסצנטית. בחירה בהגדרות “רזולוציה גבוהה” ו”ניגודיות גבוהה “בממשק המשתמש של TEM תהפוך את זה לפשוט (לחצנים בתחתית חלון המסך הפלואורסצנטי). לחלופין, אם יש גישה למצלמה עם מצב חי, אז זה יכול לשמש כדי לקבוע את הגובה eucentric; זה יהיה קל יותר מאשר על המסך פלואורסצנטי.

המגבלות הגדולות ביותר בגרסאות Tomo5 לפני 5.8 הן מונטאז’ים חסרים של הגדלה בינונית, סכימה סימטרית במינון חסר ובעיות הקשורות למציאת גובה יוצנטרי. אלה קיימים ב- serialEM, תוכנה חופשית עם פיתוח מהיר ותמיכה קהילתית, שגרת גובה אאוצנטרית חזקה, ואפשרות לסקריפט, כלומר, סכימה סימטרית מינון שנבנתה בהתאמה אישית. מגרסה 5.8 ואילך ב-Tomo5, הבעיה הנפוצה ביותר למציאת הגובה האוצנטרי, כלומר לולאה לא מוצלחת סביב ערך z היעד, נפתרה על ידי יישום האפשרות לקבוע קריטריון קבלת גובה יוצנטרי. עם זאת, עם סוגי רשת ודגימות שונים, מומלץ מאוד להתאים את הגדרות מסנן התמונה כדי לשקף את תנאי ההדמיה הייחודיים של הפעלות בודדות ולתת את שיא המתאם הצולב הטוב ביותר האפשרי כדי למצוא את הגובה האאוצנטרי וכדי שאזור המיקוד והמעקב יעבוד באופן אמין במהלך רכישת טומוגרמה.

בסך הכל, מתקנים רבים הסתגלו במהירות להפעלה מרחוק במהלך המגיפה. תוכנת Tomo5 מספקת גישה קלה ומסלול ידידותי למשתמש לטומוגרפיה המתאימה היטב להפעלה מרחוק. ההתקדמות שנעשתה בתוכנה ללא ספק תמשיך להפוך את אוספי הנתונים המרוחקים ואת איסוף הטומוגרפיה באופן כללי למיינסטרים יותר בקהילה.

emClarity
מכיוון ש-emClarity משתמשת בשיטת בחירת חלקיקים המבוססת על תבנית, היא זקוקה לתבנית עבור מושא העניין. ליקוט החלקיקים (שלב 2.6) רגיש מאוד ומפתח למבנה הסופי. לפני ממוצע ויישור (שלב 2.9), יש להקפיד לבדוק היטב ולהסיר ידנית את התוצאות החיוביות המוטעות. כאשר תבנית אינה זמינה, emClarity עשויה להיות לא קלה לשימוש, אך ניתן להשתמש בתוכנות אחרות, לדוגמה, Dynamo37 ו- PEET48, כדי ליצור מודל ראשוני.

עבור דוגמאות הטרוגניות, emClarity מצויד בשיטת סיווג המאפשרת למשתמשים להתמקד בתכונות ספציפיות עם קני מידה שונים. כדאי להריץ כמה מחזורים של יישורים לפני הסיווג ולהפעיל אותו בבינינג גבוה יותר (כגון סל 4 או סל 3).

הגרסה העדכנית של התוכנה (V1.5.3.11) כוללת עדכונים משמעותיים בהשוואה למהדורה הראשונה (V1.0)17. אלה כוללים, בין היתר, בדיקת יד במהלך הערכת CTF (שלב 2.3); סימטריה ליישורים (CX, I, I2, O); חישוב פונקציות דגימה תלת-ממדיות לכל חלקיק (3DSF); מעבר ל- MATLAB 2019a לתאימות ויציבות; ושחזור באמצעות תמונות ההקרנה הגולמיות (cisTEM). התוכנה תמשיך להשתפר עבור דוגמאות שונות, ואת ההכרזות החדשות ביותר ניתן למצוא באינטרנט ( ראה טבלת חומרים).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים במקור אור יהלום עבור גישה ותמיכה במתקני cryo-EM במרכז הלאומי להדמיית אלקטרונים בבריטניה (eBIC), במימון קרן Wellcome, MRC ו- BBRSC. ברצוננו גם להודות לאנדרו האו על רכישת טומוגרמה אפופריטין (סרט 1), אישיקה קומאר על ההכנה והרכישה של טומוגרמה נוירונים (סרט 2), וקרייג מקגרגור-צ’טווין על הציאנובקטריה למלה-טומוגרמה (סרט 3).

Materials

Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG – Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil – A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan –
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific –
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ – – Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ – – Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial – – Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software – – Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki – – Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461 (2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -. T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. . The IMOD Home Page Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020)
  41. . GitHub: emClarity-tutorial Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021)
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. . MotionCor2 Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016)
  44. . Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022)
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  47. . Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019)
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Tags

Cryo-electron TomographyRemote Data CollectionSubtomogram AveragingCROWETMicromoleculesNative Cellular EnvironmentTomo Five SoftwareImage Acquisition ParametersAtlasScreeningTarget SetupImage Shift CalibrationEucentric Height AdjustmentLow Dose Tomography Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image