クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

この研究で使用されたソフトウェアパッケージは、部分的に無料で入手できます( 材料表を参照)。 1. Tomo5を用いたリモートクライオETデータ取得 ソフトウェアがロードされていない場合は、TEMサーバーPCからこのソフトウェアを起動することから始めます(材料表を参照)。 初期設定を行い、 プリセットを選択して撮影条件を設定します。プリセットの[準備]タブで画像取得パラメータを調整して、セッションのセットアップを開始します(図2A、B)。「概観倍率」をグリッドスクエアのサイズと線量に合わせて調整し、適切なカウントを取得します。注: グリッド タイプに適した倍率が不明な場合は、グリッドを読み込んだ後にこの手順に戻ります。 「ユーセントリック高さ」と「検索倍率」は同じにすることができます。「トモグラフィー」 タブの検索をクリックして 位置を設定し、倍率が関心のある特徴を表示し、「露出」と「トラッキング/フォーカス」領域を視野に収めるのに十分であることを確認します(図2C)。 「露出倍率」を希望のターゲットピクセルサイズに設定します。これが不明な場合は、関心領域に合わせて倍率を目的の視野に調整して確立します。 画像取得(露出)のパラメーターを他のすべての高倍率プリセット(トラッキング、ドリフト、フォーカス、トーンリング、ゼロロス)にコピーします。これを行うには、[設定]を押して顕微鏡に[露出]を設定し、[取得]を押して、個別に選択した後、他のすべての高倍率に「露出設定」を取得します。特に「フォーカス」と「トラッキング」の露光時間を調整して、60°の厚さ、つまり0°と60°の両方を考慮して、サンプルを通過して相互相関の強力な信号を提供します。注:推定として、「露出」プリセットに等しい「トラッキング」と「フォーカス」の露出時間は、最初の測定値として適しています。「曝露」プリセットの線量計算例については、図3を参照してください。 「準備」タブで「露出」プリセットの計算された露出時間を設定します。 「ゼロロスプリセット」を調整して、より高い線量が必要なため、より明るく大きなスポットサイズを使用します(スポットサイズが大きいほど、数値は小さくなります)。注意: このプリセットは、顕微鏡上にあるエネルギーフィルターのスリットを合わせるのに最適です。 以下の手順に従ってアトラス収集を実行します。アトラスを収集するには、[アトラス]タブで [新しい セッション]をクリックし、セッションの設定を行い、ストレージパスと出力形式を入力して、[ 適用]を押します。 スクリーニング を選択し(図4)、取得するすべてのアトラスにチェックマークを付けます。 コルバルブを閉じる を選択して、顕微鏡を教師なしのままにします。これにより、選択したすべてのアトラスが収集された後にカラムバルブが閉じます。スクリーニングを開始するには、 スタート ボタンを押します。 「スクリーニング」(図4)の下の左側のパネルのグリッドをクリックして、単一または複数のアトラスでターゲットを調べ、マウスを左クリックしてドラッグして移動し、中央スクロールしてズームインおよびズームアウトします。ターゲット設定のグリッドを選択して選択し、ソフトウェア内から[サンプルのロード]をクリックします。 画像シフトキャリブレーションでは、引き続きアトラススクリーニングタブを使用して、ロードされたグリッド内を移動します。すべての倍率プリセットで認識できる識別可能な特徴、つまり、穴のエッジまたは別の認識可能な特徴と重なる氷晶を見つけます(図5)。マウスを右クリックしてその正方形に移動し、「ステージをグリッド正方形に移動」します。注:画像シフトキャリブレーションを正しく実装するには、ステージがユーセントリックの高さにある必要があります。 画像シフトキャリブレーションを実行します。「自動機能」タブ(図6)で、プリセットを「ユーセントリック高さ」に設定し、「ステージチルトによる自動ユーセントリック」に移動して 、[開始]を押します。ステータスウィンドウを監視して、ユーセントリックの高さが成功したことを確認し、正と負の傾き画像を監視します。それらは相関しなければなりません。注:Tomoソフトウェアのバージョン5.8以降、ユーセントリック高度許容の基準を変更できます。デフォルトは0.25μmで、0.5〜0.8μmに設定すると余裕があります。値は顕微鏡の性能によって異なりますが、できるだけ小さくすることをお勧めします。ユーセントリックの高さにあり、焦点が合っているときは、ステージをフィーチャの中央に配置します。「アトラス」プリセットを使用してプレビューを収集します。「準備」タブからすべての「プリセット」を設定します。その後、倍率をプレビュー >[概要>中央の特徴]に上げてから、「検索倍率」を繰り返し、最後に「露出倍率」を繰り返します。 ターゲティング中にフィーチャが中央に配置されたままの場合は、画像シフトの調整をスキップします。それ以外の場合、画像シフトを調整するには、[準備]タブに移動し、[ 画像シフトの調整]を選択して、[ 開始 ]を押します(図5)。これにより、露出倍率を中心としたフィーチャに低倍率が繰り返し位置合わせされます。注意: 最初のプリセット「露出」がこの段階で中央に配置されていない場合、再センタリングのために、ソフトウェアはこのステップにのみステージシフトを使用します。「露出」プリセットの [続行 ]を押します。次に表示される画像は「検索プリセット」になります。プリセット間の画像シフトを調整するには、「検索」プレビューで「露出」プレビューの中心がある場所を左ダブルクリックし、[ 再取得 ]を押します(図5)。[ 続行 ]をクリックして、次のプリセットのペアに移動します。注意: このキャリブレーション中にアトラス倍率での画像シフトが適用された場合は、画像シフトキャリブレーションが完了した後にアトラスを再取得してください。目的のアトラスを選択し、トップパネルの[アトラス]タブで [選択をリセット ]を押します。確認して、そのアトラスの取得を再開します。 トモグラフィーのセットアップを実行します。「トモグラフィー」タブでトモグラフィーデータ収集セットアップを作成します。注意: 特に明記されていない限り、セットアップは完全に[断層撮影]タブで行われます。 新しいセッションを開始します。生物学的サンプルの「セッション設定」で、サンプルタイプとしてスラブライクを選択し、バッチと低用量を選択し、出力形式と保存フォルダーを選択し、オプションで電子メール受信者を追加して、[適用]を押します。注意: 「バッチ位置」メニュー項目が使用可能になります(図7A)。現在ロードされているアトラスは自動的にインポートされます。「概要」と「検索画像」は、新しい画像を取得するまで取得して再訪することができます。また、バージョン5.8からは、「検索マップ取得」で3×3、4×4、5×5タイルの検索マップを取得できるようになり、ターゲットの検索や設定が容易になりました。それらは中倍率のモンタージュのバージョンに対応しています。 ターゲットを設定するには、「アトラス矢印」に移動し、関心のある領域を見つけて、マウスの右クリックでポップアップするオプションを選択してそこに移動します。概観画像を撮影してユーセントリックの高さ調整に適した位置を確認し、 自動ユーセントリックを押します。これにより、ユーセントリックバイステージチルトルーチンが実行されます。次に、新しい概観図画像を再取得して、ユーセントリック高度を更新します。注意: 位置がユーセントリックの高さにある場合、「オートフォーカス」ボタンは必要ありません。ユーセントリック高さの画像が焦点から大きく外れているように見える場合は、ユーセントリックの高さが正しくない可能性があり、やり直す必要があります(ユーセントリック高さのトラブルシューティングについては、説明のセクションを参照してください)。 最初の位置を設定する前に、「概要」プリセットを使用してターゲットを確認します。「概要」プリセットを選択し、ステージを±60°に傾けて、位置を設定できるグリッドバーからの距離を確認します(図8)。これを実行するには、目的の傾斜角度の値を「傾斜の設定」ウィンドウに入力します(図8A)。 四角い「概要」または取得した「地図検索」を調べ、関心領域に移動して、 検索を取得を押します。「検索」画像を調べます。関心領域が中央に配置されていない場合は、目的の位置を右クリックし、[ ここにステージを移動 して 画像を取得]を繰り返します。[傾斜 (°)] を 0.00 (またはステージが処理できるその他の開始角度) に設定して、断層図の開始角度を定義します。最初の断層撮影では、目的の断層像命名 規則の名前を入力し 、各断層図に必要な焦点ぼけ値を設定するための焦点ぼ け を入力します。 オプションで、Tomoバージョン5.8以降では、デフォーカス値を一度に体系的に変更できます。そのためには、[位置の選択]をクリックし、変更する位置を選択するか、チェックマークにチェックマークを付けてすべての 位置を選択し、[ デフォーカスの更新 ]をクリックしてパラメーターを調整します(図7A)。 「フォーカス」と「トラッキング」領域を調整します(図2C)。左クリックして、トラッキング領域とフォーカス領域(黄色と青色の円)をドラッグします。トラッキング/フォーカスエリアが(ほとんど)カーボンまたは別の適切なトラッキング機能、つまり関心領域と同様の機能上にあることを確認します。亀裂、氷の汚染、厚すぎる領域、空の穴を避けてください。多くのトラッキング機能のないブランクカーボンを選択する場合は、焦点を合わせるのに十分な高さの線量を選択し、より高い傾斜でサンプルをゆっくりと燃焼するようにトラッキングすることにより、トモグラムの途中で領域が燃焼し始めることを確認してください。これは、追跡精度を維持するのに役立ちます。トラッキング/フォーカス領域が後の取得領域を公開していないことを確認します。注意: 何が近くにあり、何がビームに入るかに注意してください。グリッド バーなど、トラッキングや露出に干渉するフィーチャを含む領域は避けてください。 すべてのパラメータが設定され、目的の関心領域と「フォーカス」と「トラッキング」が定義されたら、[ 位置の追加 ]を押します。新しいターゲットについても繰り返します。注:ユーセントリック高さが設定されたバッチ位置に対して正しく校正されていることを確認するには、いくつかの利用可能な方法があります。実行される断層撮影セッションのタイプ(分子、細胞、ラメラ)に基づいて1つを選択することをお勧めします。 分子断層撮影の場合、グリッドがかなり平坦で、ターゲット位置を含む各正方形の中心でユーセントリック高さが実行されていると仮定すると、「すべて絞り込み」(または位置が選択されている場合は選択を絞り込む、 図7A)手順をスキップします。Tomoがステージチルトによる自動ユーセントリックルーチンに苦労している場合は、おそらく スキップユーセントリックをクリックします。細胞サンプルまたはラメラサンプルの場合、各バッチ位置は異なるz高さにある場合があります。「すべて絞り込み」を使用して注意するか、「ユーセントリックをスキップ」オプションにチェックを入れないでください。注意: 「すべて絞り込み」は、「位置の選択」で設定または選択されたすべての断層撮影を繰り返します。ユーセントリック高さを調整し、データ収集の前に追跡とフォーカスを実行します。この手順では、次のトモグラムフォーカス/トラッキング領域(図7B)からのオーバーラップ露出を露出させる可能性があり、先に進む前に考慮する必要があります。 絞り込みに失敗した正方形を確認して再訪します。マウスの右ボタンで、 失敗した位置 をクリックしてオプションを表示します。ユーセントリックの高さが失敗した場合は、「ステージチルトによる自動ユーセントリック」(ステップ1.4.1)を見つけ、新しい「検索」画像を取得してz高さを更新し、「位置を追加」します。失敗した/以前に初期化された位置を削除します。クリックしてください ユーセントリックをスキップ 「すべて絞り込む」で行われたオプション。注: [すべて絞り込み] が実行されていない場合は、[ユーセントリックをスキップ] をオンにしないでください。Tomo5は、各トモグラムが取得される前にユーセントリックリファインを実行します。このようにして、ユーセントリックリファインに失敗したポジションはスキップされます。 以下の手順に従って自動機能を実行します。設定を確認して、[自動機能]タブでアトラスをカーボンの領域に移動して、アライメントを実行します。その領域をユーセントリックの高さにし、以下に示すように配置の順序に従います。「ユーセントリック高さ」プリセットを使用して、ステージチルトによって 自動ユーセントリック を実行します。 「フォーカス」プリセットを使用して オートフォーカスルーチン を実行します。 「トーンリング」プリセットを使用して オートスティグメイト ルーチンを実行します。 「トーンリング」プリセットを使用して オートコマ ルーチンを実行します。 目的の対物レンズアパーチャ(図6B)、おそらく100μmアパーチャを挿入します。 絞り挿入後に オートスティグメイト ルーチンを繰り返します。注:ピクセルサイズが約3 Å以下の解像度の倍率では、オートコマルーチンが失敗する可能性があります。この場合、TEMユーザーインターフェイスの直接位置合わせの下にあるTomo回転中心を確認して位置合わせします。 自動ゼロロスセンタリングルーチンがサンプルで機能することを確認してください。適度に高用量でプリセットされた「ゼロロス」(ステップ1.2.3)を使用すると、自動機能のルーチンが成功する可能性が高くなります。 データ収集を実行します。「トモグラフィー」タブで自動取得を開始するには、 データ収集 スラブアウトを選択し、目的のパラメータを設定します(図7C)。データ取得パラメータの設定:チルトステップ(°)、最大正の角度(°)、最大負の角度(°)、トラッキングスキーム(推奨: 取得前にトラック/フォーカスを選択)。ユーセントリック高さスキームの クローズコラムバルブ を選択します。注意: めったに使用されないパラメータは、「露出時間の調整」、「ZLPの調整」、「位相板の使用」、「傾斜後に一時停止」です。STAを対象としていない断層撮影の 露出時間の調整 を使用して、傾斜が大きいときに指定した比率で露光時間を増やします。 [ZLP の調整] オプションは、周期性の設定に関係なく、各トモグラムの後に ZLP リファインメントを実行します。それは遅く、明白な理由なしに失敗することがあり、そのポジション取得をスキップします。ただし、非常に狭いスリット幅、つまりSelectris(X)フィルターで3〜5 eVの場合に役立ちます。 フェーズプレートの使用は 、エネルギーフィルター付きのDEDの導入以来、めったに使用されていません。 [傾いた後に一時停止] は集録を一時停止しますが、ソフトウェアの変更は許可しません。 データ収集パラメータ(「準備」タブ)を再確認し、線量計算と希望の傾斜スキームに同意し、「曝露」プリセットで 分数(Nr.) を指定してから、取得を開始します。注:分数の数は、サンプル、取得パラメータ、および計画された後処理ステップ、つまりSTAと形態素解析によって異なり、動き補正とCTF推定が十分な信号を得る値に保つ必要があります。4〜10フラクションの範囲は適切な推定値であり、4はより厚いサンプルに適しており、10はより薄い分子サンプルに適しています。次に、[ 開始 ]をクリックしてデータ収集を開始し、最初の断層撮影を監視して、断層撮影が意図したとおりに取得されていることを確認します。注意: 最近のトモグラフィーソフトウェアバージョンには、取得したトモグラムを視聴できる[トモグラフィー]タブに追加のムービープレーヤースラブアウトがあります。ロードプロセス中はしばらくお待ちください。 2. エムクラリティを用いたアポフェリチンのクライオET STA 注:ここでは、EMクラリティソフトウェア17 を使用して、STAによるクライオET構造決定を説明する。 図 9 はこのプロセスをまとめたものです。例として、6つのチルトシリーズのアポフェリチン(EMPIAR-10787)を取り上げました。八面体対称性が適用され、最終的なマップの解像度は2.86 Åで、わずか4,800個の粒子から得られ、ナイキスト周波数(2.68 Å)に近くなりました。 emClarityソフトウェアパッケージ39 がダウンロードされ、インストールされていることを確認します( 材料表を参照)。ソフトウェア処理用のIMODをインストールする40.メモ: Linux コマンドの基本的な知識が必要です。より詳細なチュートリアルは参考文献41にあり、リボソームデータセット(EMPIAR-10304)を例として取り上げ、段階的な手順を説明しています。さまざまな種類のタンパク質サンプルについて、以前に公開されたレポートも利用できます42。 入力ファイルとディレクトリを準備します。注:生のフレームは、MotionCor2(パッチ5 x 5)43 によってモーション補正されました( 材料の表を参照)。動き補正された画像を積み重ねて、newstack(IMOD)を使用してチルトシリーズを生成し、Etomo( 材料表を参照)を使用してパッチトラッキングと手動で位置合わせし、続いてemClarityを使用しました。より良い位置合わせを得るには、Etomoでオフセットと傾き補正を実行することをお勧めします。6つのチルトシリーズはTS1からTS6に改名されています。以下は、例としての最初のチルトシリーズ(TS1)の手順とコマンドです。プロジェクト フォルダーを確立します。注: ソフトウェアの最新バージョンは 1.5.3.11 です。関連するすべてのソフトウェア ログは、ローカル プロジェクト フォルダー (…/logFile/emClarity.logfile) にあります。 プロジェクト フォルダーの下に、別の新しいフォルダー “fixedStacks” を作成し、TS1.fixed、TS1.xf、および TS1.tlt の入力ファイルを準備します。注:TS1.fixed:オリジナルのチルトシリーズ、Etomoでは TS1.st としても知られています。TS1.xf:このファイルには、Etomoチルタライン後の変換座標が含まれています。TS1.tlt:このファイルには傾斜角が含まれています。 以下の手順に従って、焦点ぼけを推定します。焦点ぼけを計算します。 補足表1に続く顕微鏡およびイメージングパラメータでパラメータファイルを更新します。パラメーター ファイルをプロジェクト フォルダーにコピーし、その名前を param_ctf.m に変更して、 emClarity ctf 推定値 param_ctf.m TS1 を実行します。注: パラメータ ファイル テンプレートは、 補足ファイル 1 またはローカル ソフトウェア インストール ディレクトリ (…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/) にあります。 各スタックのCTF推定結果を確認します。3dmodを使用して位置合わせされたスタック(aliStacks/TS1_ali1.fixedなど)をチェックし、基準ビーズが正しく消去されていることを確認します。 ログファイル/emClarity.logファイル(図9)にある利き手が正しいことをログファイルで報告していることを確認します。 デフォーカス値 (fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf など) を確認し、理論上の CTF 推定値と一致することを確認します。 サブ領域を定義します。ビン断層撮影を生成します。プロジェクト フォルダーで、 sh recScript2.sh -1 を実行します。注:各スタックの小さい(サイズの)トモグラムは、新しいフォルダ「bin10」に保存されます。プロセスを高速化するために、1つまたは複数のサブ領域の座標をbin10断層画像で定義することができます。スクリプト ファイルは、ローカル ソフトウェア インストール ディレクトリ (…/emClarity_1.5.3.11/docs/) にあります。 境界を決定するには、x 最小値、x 最大値、y最小値、y最大値、Z最小値、Z最大値の 6 つのポイントを選択して、1 つのサブ領域を作成します。フォルダ “bin10″の下で、次のコマンドを実行します:3dmod TS1_bin10.rec。注: 1 つの傾斜系列に 4 つのサブ領域を作成する場合は、6 × 4 = 24 ポイントを選択します。各スタックには、フォルダー “bin10” の下に 1 つのモデル ファイル (*.mod) が必要です。 モデル ファイルを emClarity 形式に変換します。これにより、新しいフォルダーの偵察が作成されます。このフォルダーの下に各サブ領域のすべての座標を格納します。プロジェクト フォルダーで、 sh recScript2.sh TS1 を実行します。 パーティクルを選択します。粒子をピッキングするためのアポフェリチンテンプレートを見つけます。電子顕微鏡データバンク (EMD-10101)44 からテンプレートをダウンロードします。テンプレートのピクセル サイズが生データのピクセル サイズと一致していることを確認します。プロジェクト フォルダーで、 emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu を実行します。 粒子ピッキング用のCTF補正断層撮影を生成します。プロジェクトフォルダで、 emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearchを実行します。 サブ領域ごとにパーティクル ピッキングを実行します。アポフェリチンデータセットについては、bin6でテンプレート検索を実行します。Tmp_angleSearchパラメータ(θアウト、Δアウト、θイン、Δイン)を変更して、面内または面外検索の角度範囲と間隔を度単位で決定します。プロジェクト フォルダーで、emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1 を実行します。注: この手順では、フォルダー “convmap_wedge_Type2_bin6” が生成されます。このフォルダの下にあるcsvファイル(TS1_1_bin6.csvなど)には、選択されたパーティクルに関するすべての情報が含まれています。 3dmodを使用して誤ったパーティクルを削除します。フォルダ “convmap_wedge_Type2_bin6″の下で、次のコマンドを実行します: 3dmod ../cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.注意: これらの領域のカーボンエッジや氷の汚染の隣に間違った粒子を見つけるのはよくあることです。間違ったポイントを右クリックし、キーボードの バックスペース を押して削除します。この手順では、ほとんどの誤検知ポイントが削除されていることを確認します(図10)。 emClarityが次の手順でconvmapの下のサブリージョン情報を見つけるので、フォルダ名「convmap_wedge_Type2_bin6」を「convmap」に変更します。 プロジェクトを初期化します。プロジェクトフォルダで、 emClarity init param0.mを実行して、 emClarity、ApoF.mat用のデータベースを作成します。 STAとアライメントの前に断層撮影の再構成を行います。bin4でCTF補正されたサブ領域断層撮影を生成するには、 emClarity ctf 3d param0.mを実行します。注:CTF補正された断層撮影(たとえば、cache/TS1_1_bin4.rec) は、新しいフォルダ「キャッシュ」に生成されます。 STA とアライメントを実行します。bin4から始まるCTF補正サブトモグラムを使用して平均化を実行します。プロジェクト フォルダーで、 emClarity avg param0.m 0 RawAlignment を実行します。 アライメントを続けて実行します: emClarity alignRaw param0.m 0。注: 平均化ステップでは、このステップで emClarity がパーティクルを整列させるために使用する参照が生成されます。Raw_angleSearchパラメータ(θout、Δout、θin、Δin)を変更して、各サイクルの角度範囲とステップサイズを設定できます。ほとんどの不正なパーティクルがデータベースから削除されるため(ステップ 2.6.4)、アライメントのこれらの角度設定は比較的小さな角度から開始できます。 Raw_angleSearchパラメーターを更新し、さらにいくつかのサイクルを実行します (ステップ 2.9.1 および 2.9.2)。プロセスを高速化するには、面内アライメントと面外アライメントを別々に実行します。注意: ビニングごとに、複数のサイクルを実行し、角度設定を徐々に減らすことをお勧めします。ApoFデータセットについては、ビン4でさらに5サイクルが実行され、詳細は補足表2に記載されています。cycle001 の場合は、プロジェクト フォルダーで、emClarity avg param1.m 1 RawAlignment を実行し、続いて emClarity alignRaw param1.m 1 を実行します。 重なった粒子をきれいにします。プロジェクト フォルダーで、 emClarity removeDuplicates param5.m 5 を実行します。 トモCPRでチルトシリーズリファインを実行します。注: この手順はオプションです。tomoCPR を実行して、スタック ジオメトリを調整します。プロジェクトフォルダで、 emClarity tomoCPR param5.m 5を実行します。 新しく位置合わせされたスタックを生成し、ジオメトリ ファイルを更新します。プロジェクトフォルダで、 emClarity ctf update param6.mを実行します。注: 新しいジオメトリ ファイル (fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt など) と新しく位置合わせされたスタック (aliStacks/TS1_ali2.fixed など) が正しく生成されていることを確認します。 bin2に新しいサブトモグラムを作成します。プロジェクト フォルダーで、 emClarity ctf 3d param6.m を実行します。注意: これに続いて、bin2での平均化と位置合わせ(ステップ2.9.1、2.9.2、および2.9.3)、重複クリーニング(ステップ2.9.4)、およびオプションのtomoCPR(ステップ2.10)の数サイクルが続きます。高い対称性のために、bin2でさらに5サイクルをアポフェリチンについて行った。各サイクルのRaw_angleSearchパラメータを更新します。 最終的な再構築を実行します。bin1 および tomoCPR で数サイクル実行を続けます (ステップ 2.9 およびステップ 2.10)。アポフェリチンデータセットに対して、bin1でさらに10サイクルを実行しました。コマンドおよびパラメーターの詳細については、 表 2 を参照してください。 2 つのハーフ データセットを組み合わせて最終的な再構築を実行します。プロジェクト フォルダーで、emClarity avg param21.m 21 RawAlignment を実行し、続いて emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment を実行します。注: 最終的なマップ(たとえば、B 係数が 10、cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) が生成されます ( 図 11)。