JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني جمع البيانات عن بعد ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63923
, , ,
1Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics,University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute,University of Oxford

Summary

يصف هذا البروتوكول الحصول على بيانات التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون المقطعي عن بعد عالية الدقة باستخدام Tomo5 ومعالجة البيانات اللاحقة والتصوير المقطعي الفرعي باستخدام emClarity. يستخدم Apoferritin كمثال لتوضيح العمليات التفصيلية خطوة بخطوة لتحقيق بنية cryo-ET بدقة 2.86 Å.

Abstract

يكتسب التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون (cryo-ET) زخما في السنوات الأخيرة ، خاصة منذ إدخال أجهزة الكشف عن الإلكترونات المباشرة ، وتحسين استراتيجيات الاكتساب الآلي ، والتقنيات التحضيرية التي توسع إمكانيات ما يمكن للمجهر الإلكتروني تصويره بدقة عالية باستخدام cryo-ET وبرنامج متوسط التصوير المقطعي الفرعي الجديد. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح الحصول على البيانات مبسطا بشكل متزايد ، مما يجعلها أكثر سهولة للعديد من المستخدمين. أدت جائحة SARS-CoV-2 إلى تسريع عملية جمع بيانات المجهر الإلكتروني المبرد عن بعد (cryo-EM)، خاصة بالنسبة للجسيم الأحادي الترسب الكهرومغناطيسي، في العديد من المرافق على مستوى العالم، مما يوفر للمستخدم إمكانية الوصول دون انقطاع إلى أحدث الأدوات أثناء الجائحة. مع التطورات الأخيرة في Tomo5 (برنامج التصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد) ، أصبح جمع بيانات cryo-ET عن بعد قويا وسهل التعامل معه من أي مكان في العالم. تهدف هذه المقالة إلى توفير إرشادات تفصيلية، بدءا من إعداد جمع البيانات في برنامج التصوير المقطعي لعملية جلسة جمع بيانات cryo-ET (عن بعد) مع استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل مفصل. يتم استكمال بروتوكول جمع البيانات (عن بعد) بسير العمل لتحديد الهيكل بدقة شبه ذرية بواسطة مخطط فرعي بمتوسط مع emClarity ، باستخدام apoferritin كمثال.

Introduction

من المعروف على نطاق واسع أن المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) قد شهد فترة نهضة ، مما أدى إلى تسريعه ليصبح أداة أساسية ومفيدة مركزيا في البيولوجيا الهيكلية. تطوير واستخدام كاشفات الإلكترونات المباشرة1،2،3 ، وتحسين المجاهر ومصادر الإلكترون3،4،5 ، والتحسينات في الأتمتة / الإنتاجية6،7،8،9 ، والتقدم الحسابي في تحليل الجسيمات المفردة 10،11،12،13 ، 14 والتصوير المقطعي15،16،17 كلها ، جزئيا ، مسؤولة عن النجاح الأخير لهذه التقنية. وقد طورت هذه الدوافع التكنولوجية قدرة cryo-EM على حل الهياكل الجزيئية البيولوجية الكبيرة في ظل الظروف المبردة والأصلية. إن القرارات التي يمكن الحصول عليها بسهولة كافية للنمذجة الدقيقة ذريا وقد جلبت هذه التقنية إلى طليعة ساحة البيولوجيا الهيكلية. لطالما أثبت النهج الاختزالي للتعبير عن هدف بيولوجي ذي أهمية وتنقيته نجاحه في علم البلورات الجزيئية الكبيرة (MX) للبحوث البيولوجية الأساسية واكتشاف الأدوية والعلوم الانتقالية. في نفس النهج ، يمكن ل cryo-EM الآن تقديم نتائج موازية لدراسات MX عالية الدقة. يسمى النجاح الكبير الحالي في فرع cryo-EM من البيولوجيا الهيكلية تحليل الجسيمات المفردة (SPA) ، والذي يكتسب صور إسقاط ثنائية الأبعاد عادة لعينة بروتين منقية18 للحصول على آلاف المشاهدات لجزيء بيولوجيكبير 19. تحتوي هذه الصور (1) على معلومات من مجموعة من وجهات النظر التي تمثل بشكل كامل اتجاهات الهدف في الفضاء ثلاثي الأبعاد و (2) تلتقط عدم التجانس التوافقي للجسم ، والذي يمكن فصله والتحقيق فيه لاحقا.

وهناك نهج بديل للحصول على صور الإسقاط 2D هذه للعينات البيولوجية ، حتى في الموقع وبدون تنقية ، هو التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني (cryo-ET). يلتقط Cryo-ET سلسلة من الصور لنفس الجسم بزوايا مائلة عن طريق تدوير العينة ميكانيكيا. وبالتالي ، فإن الإسقاطات ثنائية الأبعاد التي تم جمعها في SPA ، والتي تمثل الوضعيات الزاوية للجزيء محل الاهتمام ، يتم جمعها بطبيعتها كجزء من تجربة التصوير cryo-ET20. ثم يتم إعادة بناء سلسلة الإمالة المقطعية في تصوير مقطعي يحتوي على تمثيلات 3D للمجمعات الجزيئية الكبيرة المصورة. طبيعة جمع البيانات المقطعية ، إلى حد ما ، تقلل من الاعتماد على المتوسط لتحقيق تمثيل كامل 3D لجزيء من مجموعة من الصور 2D. ومع ذلك ، نظرا لتصاميم المرحلة الحالية ، تميل العينة عادة من -60 درجة إلى +60 درجة ، تاركة إسفينا مفقودا21 من المعلومات في إعادة بناء التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد.

إعادة بناء 3D في تصوير قطري واحد ثم إسفين مفقود من المعلومات وإشارة منخفضة إلى الضوضاء. يمكن استخراج الجزيئات الكبيرة الفردية كصور تحت التصوير المقطعي ومتوسطها معا لمعالجة ذلك. عندما يتم العثور على كل جزيء كبير في مخطط تحت التصوير المقطعي في اتجاه مختلف ، يتم توجيه الوتد المفقود بشكل مختلف في كل مخطط فرعي للكائن المستهدف ، لذلك فإن المتوسط على العديد من النسخ يملأ المعلومات بسبب الوتد المفقود. حاولت التطورات الأخيرة في معالجة الصور أيضا تدريب الشبكات العصبية للذكاء الاصطناعي على ملء الإسفين المفقود ببيانات ذات مغزى22. تزيد عملية المتوسط هذه أيضا من الإشارة إلى الضوضاء ، على غرار هدف المتوسط في تحليل الجسيمات المفردة ، وبالتالي تتحسن جودة إعادة الإعمار ودقتها. إذا كان جزيء الاهتمام يمتلك تناظرا ، فقد يتم تعريف ذلك أيضا واستخدامه أثناء المتوسط ، مما يزيد من تحسين دقة إعادة الإعمار. ومن المعروف استخراج أحجام 3D من الجزيء الكبير من التصوير المقطعي إلى مجموعة من subtomograms ومعالجتها اللاحقة باسم المتوسط تحت التصوير المقطعي (STA)23. عندما يمثل كل مخطط فرعي نسخة فريدة من الجزيء قيد الدراسة ، يمكن استجواب أي عدم تجانس هيكلي باستخدام سير عمل STA. وكما هو شائع الاستخدام في سير عمل SPA ، يمكن استخدام تقنيات التصنيف أثناء STA لتشريح الحالات التوافقية لمجمع الاهتمام. بالإضافة إلى STA التي تمكن من إعادة الإعمار عالية الدقة في cryo-ET ، فإن هذا النهج يجعل هذه التقنية أداة قوية لاستجواب الآليات الهيكلية للجزيئات الكبيرة في بيئتها الخلوية الأصلية أو الأهداف التي غالبا ما تكون غير قابلة ل SPA24,25,26.

التصوير المقطعي الإلكتروني لديه تاريخ طويل في تحديد البنية الفائقة 3D للعينات الخلوية في درجة حرارة الغرفة27. يوفر الحصول على وجهات النظر عن طريق الإمالة المادية للعينة معلومات كافية لإعادة بناء 3D لكائن على مقاييس الطول الخلوي ومهم بشكل خاص عندما تفتقر الهياكل الخلوية إلى الانتظام في المتوسط. يمكن أيضا تجميد الخلايا على ركائز للتصوير بالتبريد ET عند حواف الخلية حيث تكون العينة رقيقة بما يكفي لتكون شفافة للإلكترون. في ظل هذه الظروف ، يمكن استخدام STA لتحديد الهياكل الجزيئية الكبيرة في بيئة خلوية ، وإن كان ذلك عندما تكون العينة رقيقة بما يكفي لتكون شفافة للإلكترون28. ومع ذلك ، عندما يقترن بتقنيات تحضيرية إضافية ، بما في ذلك الضوء المبرد المرتبط بالتبريد والمجهر الإلكتروني (cryo-CLEM) وطحن الحزم الأيونية المركزة (cryo-FIB) ، يمكن استخدام cryo-ET للتصوير داخل خلايا كاملة تحت ظروف التبريد29. هذا يجمع بين قوة cryo-ET لدراسة البنية الفائقة الخلوية مع قوة STA لتحديد هياكل المجمعات الجزيئية الكبيرة في الموقع مع تحديد موقعها الخلوي30 وتوفير لقطات من المجمعات المشاركة في العمليات الديناميكية31. وقد أبرزت قدرة هذه التقنية على تصوير العينات الخلوية واستخدام STA في العديد من الدراسات قوة التقنية في حل الهياكل الجزيئية الكبيرة في الموقع ، حتى في درجات دقة مماثلة ل SPA32. تم العثور على فائدة أخرى في معرفة الموقع الأصلي للجزيء الكبير ، ممثلا في إعادة الإعمار 3D المصنفة النهائية في التصوير المقطعي30. لذلك ، يمكن ربط البنية الجزيئية الكبيرة بالبنية الفائقة الخلوية. من المفترض أن تؤدي هذه الملاحظات عبر مقاييس الطول إلى نتائج مهمة حيث قد ترتبط الآليات الهيكلية بالتغيرات الخلوية في سياق الدراسات الوظيفية.

يسمح Cryo-ET و STA بجمع البيانات في ثلاثة مهام سير عمل رئيسية: التصوير المقطعي الجزيئي والخلوي والرقائقي. يمكن تحديد هياكل المجمعات الجزيئية الكبيرة النقية بواسطة cryo-ET بواسطة التصوير المقطعي الجزيئي. يمكن وصف تحديد هياكل البروتين في بيئتها الخلوية حيث تكون الخلية رقيقة بما فيه الكفاية بأنها تصوير مقطعي خلوي. في الآونة الأخيرة ، مع تطوير الاستهداف والطحن المبرد ، يمكن تطبيق هذه التقنيات نفسها في سير عمل التصوير المقطعي الرقائقي لتحديد هياكل البروتين العميقة داخل الخلية في بيئتها الأصلية مع الكشف عن السياق الخلوي الذي يتم فيه ملاحظة هذه البروتينات. يمكن استخدام استراتيجيات مختلفة لجمع البيانات اعتمادا على حزم البرامج المتاحة ، والأهم من ذلك ، اعتمادا على متطلبات العينة. عادة ما تتطلب العينات الجزيئية أو غير الملتصقة على شبكة TEM النحاسية من البروتين النقي معالجة أقل ، وبالتالي تظل مسطحة وغير تالفة في الحالات المثالية. يمكن بسهولة إعداد التصوير المقطعي الإلكتروني في سلسلة عبر شبكة الكربون الثقبي للحصول بسرعة على عشرات إلى مئات من الصور المقطعية بطريقة منهجية. إن أبسط طريقة للمستخدمين لإعداد عينات التصوير المقطعي الجزيئي حيث توجد البروتينات بكثرة على الشبكة هي استخدام Tomo5 (برنامج للتصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد المستخدم في هذه الدراسة ، انظر جدول المواد). تتوفر أيضا برامج التصوير المقطعي الأخرى مثل Leginon9 و serialEM6 ؛ فهي توفر المزيد من خيارات الإعداد لنهج أكثر تخصيصا لجمع البيانات ولكنها أكثر تعقيدا وبالتالي قد يكون من الصعب التنقل فيها ، خاصة بالنسبة للمستخدمين الجدد في التصوير المقطعي والمستخدمين الذين يصلون إلى جلساتهم عن بعد. بالنسبة لمنشأة ذات قاعدة مستخدمين كبيرة ومتنوعة ، من السهل تشغيل Tomo5 في بيئة بعيدة وتدريب المستخدمين عليها. بالنسبة للخلايا الملتصقة ، تتطلب الشبكات عادة المزيد من خطوات المناولة ، وتزيد الحاجة إلى استخدام شبكات الذهب الهشة من الحاجة إلى رعاية محسنة في استراتيجيات المناولة وجمع البيانات. لتسهيل العثور على منطقة خلوية ذات أهمية وتجنب الانسداد من الشبكة نفسها بزوايا إمالة عالية ، من المفيد أيضا استخدام أحجام شبكية أكبر ، ولكن على حساب أنها أكثر هشاشة بطبيعتها. بالنسبة لعينات الصفيحة ، يتم تحديد هشاشة العينة من خلال جودة الصفيحة ، والتي يمكن أن تكون متغيرة. تزيد هذه العوامل من وقت الإعداد والاعتبارات ، ولكن زيادة القدرة على التكيف والمتانة تجعل Tomo5 مناسبا لهذا النوع من جمع البيانات. ومع ذلك، توجد سيناريوهات متخصصة لجمع البيانات لكل سير عمل. يقدم كل من BISECT و PACE-tomo (كلاهما يعمل في SerialEM) إمكانية تحويل صورة الشعاع النصية أثناء الحصول على التصوير المقطعي لزيادة سرعة جمع التصوير المقطعي28 ، خاصة في التصوير المقطعي الجزيئي. يمكن لمونتاج التكبير المتوسط (MMM) في SerialEM 6,7,33 تحديد الميزات الجزيئية واستهدافها بدقة في جميع مهام سير العمل ، على الرغم من أنه في وقت كتابة هذا التقرير ، بدأت هذه الميزات في التنفيذ في Tomo5.

مثل SPA ، أصبح الوصول إلى cryo-ET و STA متاحا بشكل متزايد من خلال التحسينات التي تم إجراؤها على برامج الاستحواذ ومجموعة كبيرة من الحزم المتاحة للتصوير الشعاعي الفرعي بمتوسط 16،17،32،34،35،36،37،38. بالإضافة إلى ذلك، خلال الجائحة، أصبح تمكين الوصول عن بعد إلى أجهزة التبريد EM أمرا ضروريا لمواصلة تشغيل المرافق الوطنية مثل مركز التصوير الحيوي الإلكتروني (eBIC) في Diamond Light Source (DLS) في المملكة المتحدة. جعلت هذه التطورات cryo-ET أكثر سهولة وقوة للباحثين الراغبين في استخدام هذه التقنية. بمجرد الحصول على البيانات ، تعد STA أداة أساسية لتحليل الأجسام المتكررة للحصول على أقصى قدر من إعادة بناء الدقة والسماح بتصنيف عدم التجانس الجزيئي الكبير. يهدف البروتوكول الحالي إلى توفير جولة مفصلة لإعداد مجهر TEM المبرد لجمع بيانات cryo-ET وكيفية إجراء متوسط التصوير المقطعي الفرعي باستخدام emClarity على مجموعة بيانات التصوير المقطعي الجزيئي للأبوفيريتين كمثال. يتطلب استخدام emClarity (برنامج للتصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون المبرد عالي الدقة ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي ، انظر جدول المواد) تشغيل البرامج النصية من سطر الأوامر ، لذلك يفترض مستوى من الإلمام بأنظمة Linux / UNIX.

يعتمد الاتصال عن بعد على بيئة الشبكة في كل معهد / مرفق. في eBIC ، يستخدم النظام البعيد برامج تسمح بجمع البيانات عن بعد على تكوين الشبكة المحدد المستخدم في Diamond. يتم تسهيل الاتصال عن بعد بالمجهر من خلال منصتين: NoMachine و TeamViewer (انظر جدول المواد). باستخدام البرنامج NoMachine، يمكن للمستخدم تسجيل الدخول إلى سطح مكتب Windows بعيد. يقع سطح مكتب Windows البعيد الذي توفره NoMachine على نفس شبكة المجهر ، وبالتالي ، يعمل كجهاز كمبيوتر دعم افتراضي للمجهر. من جهاز كمبيوتر الدعم الافتراضي ، يتصل المستخدم بالمجهر عبر برنامج TeamViewer مما يوفر الوصول المباشر والتحكم في جهاز الكمبيوتر المجهري الذي يعمل بنظام TUI و Tomo.

ويتألف هذا البروتوكول من جزأين (الخطوة 1 والخطوة 2). تركز الخطوة 1 على الحصول على بيانات cryo-ET عن بعد باستخدام Tomo5 (برنامج للتصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد). يلتقط التجول في جلسة (عن بعد) الصور بتكبيرات أعلى بشكل متزايد للسماح للمستخدم في النهاية بتوجيه برنامج التصوير المقطعي لاستهداف مناطق العينات لجمع البيانات المقطعية. ويلخص الشكل 1 هذه العملية. تفاصيل الخطوة 2 معالجة بيانات cryo-ET STA باستخدام emClarity (برنامج للتصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني عالي الدقة ومتوسط التصوير المقطعي تحت الشكل). ويلخص الشكل 9 هذه العملية.

البروتوكول مخصص للجمهور البعيد. يفترض أن الشخص جسديا في المجهر وتحميل العينات قد قام بالمحاذاة المباشرة واعتنى بضبط الكاميرا واكتساب المرجع. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يفترض وجود نظام عدسة ثلاثي المكثفات مع محمل تلقائي. لمزيد من الإرشادات التفصيلية حول برنامج التصوير المقطعي، يتوفر دليل مفصل من قبل الشركة المصنعة في زر ابدأ في Windows حيث تم تحميل البرنامج منه.

Protocol

حزم البرامج المستخدمة في هذه الدراسة متاحة جزئيا مجانا (انظر جدول المواد). 1. الحصول على بيانات cryo-ET عن بعد باستخدام Tomo5 إذا لم يتم تحميل البرنامج، فابدأ بتشغيل هذا البرنامج من كمبيوتر خادم TEM (انظر جدول المواد). قم بإجراء الفحوصات الأولية وتكوين حالة التصوير عن طريق تحديد الإعدادات المسبقة.ابدأ إعداد الجلسة عن طريق ضبط معلمات الحصول على الصورة في علامة التبويب “إعداد” ضمن الإعدادات المسبقة (الشكل 2A ، B).اضبط “تكبير النظرة العامة” ليناسب حجم الشبكة المربعة والجرعة للحصول على أعداد كافية.ملاحظة: إذا كان التكبير المناسب غير معروف لنوع الشبكة، ارجع إلى هذه الخطوة بعد تحميل شبكة. يمكن أن يكون “الارتفاع المتمركز حول الأرض” و “تكبير البحث” هو نفسه. انقر فوق بحث في علامة التبويب “التصوير المقطعي” لإعداد المواضع والتأكد من أن التكبير كاف لإظهار السمة المميزة للاهتمام ولتناسب منطقة “التعرض” و “التتبع / التركيز” في مجال الرؤية (الشكل 2C). اضبط “تكبير التعرض” على حجم البكسل المستهدف المطلوب. إذا كان هذا غير معروف ، فقم بإنشائه عن طريق ضبط التكبير على مجال الرؤية المطلوب ليناسب منطقة الاهتمام. انسخ معلمات الحصول على الصورة (التعريض الضوئي) إلى جميع الإعدادات المسبقة الأخرى عالية التكبير (التتبع ، الانجراف ، التركيز البؤري ، حلقة Thon ، صفر خسارة ،). للقيام بذلك ، اضغط على Set (تعيين ) لتعيين “التعرض” على المجهر واحصل على “إعدادات التعرض” لجميع التكبيرات العالية الأخرى بعد تحديدها بشكل فردي.اضبط أوقات التعرض ، خاصة بالنسبة ل “التركيز” و “التتبع” لإعطاء عدد مناسب من الأعداد ، مع مراعاة السماكة عند 60 درجة ، وهذا يعني عند 0 درجة و 60 درجة ، لعدد كاف من الإلكترونات للمرور عبر العينة لتوفير إشارة قوية للارتباط المتبادل.ملاحظة: كتقدير، تعد أوقات التعرض ل “التتبع” و “التركيز” المساوية للإعداد المسبق ل “التعرض” مقياسا أوليا جيدا. للحصول على مثال لحساب الجرعة للإعداد المسبق “التعرض”، انظر الشكل 3. اضبط وقت التعرض المحسوب للإعداد المسبق ل “التعرض” في علامة التبويب “التحضير”. اضبط “الإعداد المسبق لانعدام الخسارة” لاستخدام حجم بقعة أكثر إشراقا وأكبر (حجم بقعة أكبر يتوافق مع عدد أصغر) ، لأن هذا يحتاج إلى جرعة أعلى.ملاحظة: من الأفضل استخدام هذا الإعداد المسبق لمحاذاة شق مرشح الطاقة إذا كان موجودا على المجهر. قم بإجراء جمع الأطلس باتباع الخطوات أدناه.لجمع أطلس ، انقر فوق جلسة جديدة في علامة التبويب “أطلس” ، واضبط تفضيلات الجلسة ، وأدخل مسار التخزين وتنسيق الإخراج ، واضغط على تطبيق. حدد الفرز (الشكل 4) ثم حدد جميع الأطالس التي سيتم الحصول عليها. حدد إغلاق صمامات كول لترك المجهر دون إشراف ؛ سيؤدي ذلك إلى إغلاق صمامات العمود بعد جمع جميع الأطالس المحددة. لبدء الفحص، اضغط على الزر ابدأ ( Start ) . افحص الأطالس المفردة أو المتعددة بحثا عن الأهداف من خلال النقر على الشبكة في اللوحة اليسرى ضمن “الفحص” (الشكل 4) ، ثم انقر بزر الماوس الأيسر واسحب الماوس للتنقل والتمرير الأوسط للتكبير والتصغير. اختر الشبكة لإعداد الهدف ، وحددها ، وانقر فوق تحميل عينة من داخل البرنامج. بالنسبة لمعايرات إزاحة الصورة، استمر في استخدام علامة تبويب فحص أطلس للتنقل داخل الشبكة المحملة. ابحث عن ميزة يمكن التعرف عليها في جميع الإعدادات المسبقة للتكبير، أي بلورة ثلج تتداخل مع حافة ثقب أو ميزة أخرى يمكن التعرف عليها (الشكل 5). انتقل إلى هذا المربع بنقرة ماوس بزر الماوس الأيمن ، ثم “نقل المرحلة إلى مربع الشبكة”.ملاحظة: يجب أن تكون المرحلة في ارتفاع eucentric لتنفيذ معايرات إزاحة الصورة بشكل صحيح. قم بإجراء معايرة إزاحة الصورة.في علامة التبويب “الوظائف التلقائية” (الشكل 6) ، اضبط الإعداد المسبق على “ارتفاع Eucentric” ، وانتقل إلى “Auto-Eucentric by Stage Tilt” ، واضغط على Start. راقب نافذة الحالة لضمان نجاح العثور على الارتفاع المركزي وراقب صور الإمالة الإيجابية والسلبية ؛ يجب أن تربط.ملاحظة: من الإصدار 5.8 من برنامج Tomo ، يمكن تعديل معيار قبول الارتفاع eucentric ؛ الافتراضي هو 0.25 ميكرومتر ، وتعيينه على 0.5-0.8 ميكرومتر يعطي مساحة أكبر. تعتمد القيم على أداء المجهر ، ولكن يوصى بأن تكون صغيرة قدر الإمكان.عندما تكون في ارتفاع eucentric وفي التركيز البؤري ، قم بتوسيط المسرح على ميزة. اجمع معاينة باستخدام الإعداد المسبق “Atlas”. اضبط جميع “الإعدادات المسبقة” من علامة التبويب “إعداد”. بعد ذلك، قم بزيادة التكبير إلى ميزة “نظرة عامة > المركز” > “معاينة”، ثم كرر “تكبير البحث”، وأخيرا، “تكبير التعرض”. إذا ظلت الميزة متمركزة أثناء الاستهداف، فتخطى معايرات إزاحة الصورة. وإلا، لمعايرة إزاحة الصورة، انتقل إلى علامة التبويب “إعداد”، وحدد معايرة إزاحة الصورة، واضغط على ابدأ (الشكل 5). سيؤدي ذلك إلى محاذاة التكبيرات السفلية بشكل متكرر مع الميزة التي تتمحور حول تكبير التعريض الضوئي.ملاحظة: إذا لم يتم توسيط “التعرض” المبدئي المعين مسبقا في هذه المرحلة، لإعادة التمركز، فسيستخدم البرنامج إزاحة المرحلة لهذه الخطوة فقط.اضغط على متابعة للإعداد المسبق ل “التعرض”. ستكون الصورة التالية المعروضة هي “الإعداد المسبق للبحث”. لمعايرة إزاحة الصورة بين الإعدادات المسبقة ، انقر نقرا مزدوجا بزر الماوس الأيسر في معاينة “البحث” إلى حيث يوجد مركز معاينة “التعرض” ، ثم اضغط على إعادة اكتساب (الشكل 5). انقر فوق متابعة للانتقال إلى الزوج التالي من الإعدادات المسبقة.ملاحظة: إذا تم تطبيق إزاحة صورة عند تكبير الأطلس أثناء هذه المعايرة، فتأكد من إعادة اكتساب الأطلس بعد اكتمال معايرة إزاحة الصورة. حدد الأطلس المطلوب واضغط على إعادة تعيين محدد في اللوحة العلوية في علامة التبويب “أطلس”. تأكد وابدأ في الحصول على هذا الأطلس مرة أخرى. قم بإجراء إعداد التصوير المقطعي.قم بإنشاء إعداد جمع بيانات التصوير المقطعي في علامة التبويب “التصوير المقطعي”.ملاحظة: ما لم يذكر على وجه التحديد، يتم الإعداد بالكامل في علامة التبويب “التصوير المقطعي”. بدء جلسة عمل جديدة. في “إعداد الجلسة” للعينات البيولوجية، اختر يشبه البلاطة كنوع العينة وحدد دفعة وجرعة منخفضة، وحدد تنسيق الإخراج ومجلد التخزين، وأضف مستلم بريد إلكتروني اختياريا، ثم اضغط على تطبيق.ملاحظة: يصبح عنصر قائمة “مواضع الدفعات” متاحا الآن (الشكل 7A). يتم استيراد الأطلس المحمل حاليا تلقائيا. يمكن الحصول على “نظرة عامة” و “البحث عن الصور” وإعادة النظر فيها حتى يتم الحصول على صورة جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، من الإصدار 5.8 ، يمكن الحصول على خرائط البحث من البلاط 3 × 3 و 4 × 4 و 5 × 5 باستخدام “الحصول على خريطة البحث” لتسهيل العثور على الهدف وإعداده. وهي تتوافق مع نسخة من مونتاج التكبير المتوسط. لإعداد الأهداف ، انتقل إلى “سهم Atlas” ، وابحث عن منطقة ذات أهمية ، وانتقل إلى هناك عن طريق تحديد الخيارات التي تنبثق بنقرة مارقة بزر الماوس الأيمن. التقط صورة عامة لتأكيد وضع جيد لضبط الارتفاع eucentric ، ثم اضغط على Auto Eucentric ؛ سيؤدي ذلك إلى تشغيل روتين إمالة المسرح eucentric. بعد ذلك، أعد الحصول على صورة نظرة عامة جديدة لتحديث الارتفاع المتمركز حول eucentric.ملاحظة: لا ينبغي أن يكون زر “التركيز البؤري التلقائي” ضروريا إذا كان الموضع على ارتفاع متساوي المركز. إذا ظهرت صورة الارتفاع eucentric بعيدا عن التركيز البؤري ، فمن المحتمل ألا يكون الارتفاع eucentric صحيحا ويجب إعادة بنائه (لاستكشاف أخطاء الارتفاع eucentric وإصلاحها ، راجع قسم المناقشة). تحقق من الهدف باستخدام الإعداد المسبق “نظرة عامة” قبل إعداد الموضع الأول ؛ حدد الإعداد المسبق ل “نظرة عامة” وقم بإمالة المرحلة إلى ±60 درجة للتحقق من المسافة من أشرطة الشبكة التي يمكن إعداد المواضع (الشكل 8). قم بإجراء ذلك عن طريق إدخال قيمة زاوية الإمالة المطلوبة في نافذة “ضبط الإمالة” (الشكل 8A). افحص مربع “نظرة عامة” أو “خريطة البحث” التي تم الحصول عليها، وانتقل إلى منطقة ذات أهمية، واضغط على اكتساب بحث. افحص صورة “البحث”. إذا لم تكن المنطقة محل الاهتمام في الوسط، فانقر بزر الماوس الأيمن فوق الموضع المطلوب ثم كرر نقل المرحلة هنا والحصول على صورة. اضبط الإمالة (°) على 0.00 (أو أي زاوية بداية أخرى يمكن للمرحلة التعامل معها) لتحديد زاوية بدء التصوير المقطعي.بالنسبة إلى التصوير المقطعي الأول، أدخل اسم اصطلاح تسمية التصوير المقطعي المطلوب وإلغاء التركيز البؤري لتعيين قيمة إلغاء التركيز البؤري المطلوبة لكل تصوير مقطعي. اختياريا ، من Tomo الإصدار 5.8 فصاعدا ، يمكن تغيير قيم إلغاء التركيز البؤري بشكل منهجي دفعة واحدة ؛ لذلك ، انقر فوق تحديد المواقف ، وحدد المواقف المراد تغييرها أو حدد علامة الاختيار لتحديد جميع المواقف ، ثم انقر فوق تحديث إلغاء التركيز وضبط المعلمات (الشكل 7A). اضبط منطقة “التركيز” و “التتبع” (الشكل 2C). انقر بزر الماوس الأيمن لسحب منطقتي التتبع والتركيز (الدوائر الصفراء والزرقاء). التأكد من أن منطقة التتبع / التركيز (في الغالب) على الكربون أو أي ميزة تتبع مناسبة أخرى ، أي ميزة مماثلة للمنطقة ذات الاهتمام ؛ تجنب الشقوق وتلوث الجليد والمناطق السميكة للغاية والثقوب الفارغة.عند اختيار الكربون الفارغ بدون العديد من ميزات التتبع ، تأكد من أن المنطقة تبدأ في الاحتراق في منتصف الطريق من خلال التصوير المقطعي عن طريق اختيار جرعة عالية بما يكفي للتركيز ، والتتبع لحرق العينة ببطء عند إمالات أعلى. يمكن أن يكون هذا مفيدا للحفاظ على دقة التتبع. تأكد من أن منطقة التتبع/التركيز البؤري لا تعرض منطقة اكتساب لاحقة.ملاحظة: كن حذرا مما هو قريب وما سيأتي في الشعاع. تجنب المناطق ذات الميزات التي ستتدخل في التتبع و/أو التعرض، بما في ذلك أشرطة الشبكة. اضغط على إضافة موضع بمجرد تعيين جميع المعلمات وتحديد منطقة الاهتمام المطلوبة و “التركيز” و “التتبع”. كرر ذلك للأهداف الجديدة.ملاحظة: للتحقق من معايرة الارتفاع eucentric بشكل صحيح لمواضع الدفعات التي تم إعدادها، هناك العديد من الاستراتيجيات المتاحة. يوصى باختيار واحدة بناء على نوع جلسة التصوير المقطعي التي يتم إجراؤها (الجزيئية والخلوية والصفائح). بالنسبة للتصوير المقطعي الجزيئي ، على افتراض أن الشبكات مسطحة إلى حد ما وتم إجراء ارتفاع متمركز في وسط كل مربع يحتوي على مواضع مستهدفة ، تخطي إجراء “تحسين الكل” (أو تحسين الموضع المحدد إذا تم اختيار المواضع ، الشكل 7A). إذا كان Tomo يكافح مع روتين الإمالة التلقائي عن طريق المسرح ، فربما انقر فوق Skip Eucentric.بالنسبة للعينات الخلوية أو الصفائحية ، قد يكون كل موضع دفعة على ارتفاع z مختلف. إما استخدام “تحسين الكل” لتوخي الحذر أو عدم وضع علامة على خيار “تخطي Eucentric”.ملاحظة: سيتم تكرار “تحسين الكل” من خلال جميع الصور المقطعية التي تم إعدادها أو اختيارها عبر “تحديد المواقف” ؛ تحسين الارتفاع المتمركز وإجراء التتبع والتركيز قبل الحصول على البيانات. يمكن أن يكشف هذا الإجراء عن أي تعرض متداخل من منطقة التركيز / التتبع التالية للتصوير المقطعي (الشكل 7B) ، والتي ينبغي مراعاتها قبل المتابعة. تحقق من المربعات التي فشلت في التحسين وإعادة النظر فيها. باستخدام زر الماوس الأيمن ، انقر فوق الموضع الفاشل لرؤية الخيارات. في حالة فشل الارتفاع eucentric ، ابحث عن “Auto-eucentric by stage-tilt” (الخطوة 1.4.1.) ، واحصل على صورة “بحث” جديدة لتحديث ارتفاع z ، و “إضافة موضع”. حذف الموضع الفاشل/الذي تمت تهيئته مسبقا. انقر فوق خيار تخطي Eucentric ، والذي تم إجراؤه باستخدام “تحسين الكل”.ملاحظة: إذا لم يتم تشغيل “تحسين الكل”، فيجب عدم التحقق من “تخطي Eucentric”. سيقوم Tomo5 بتشغيل الصقل eucentric قبل الحصول على كل تصوير مقطعي ؛ وبهذه الطريقة ، سيتم تخطي المواقف التي تفشل في الصقل المتمركز حول eucentric. قم بتنفيذ وظائف تلقائية باتباع الخطوات أدناه.تحقق من الإعدادات لإجراء المحاذاة عبر علامة التبويب “الوظائف التلقائية” عن طريق التنقل في الأطلس إلى منطقة من الكربون. أحضر هذه المنطقة إلى ارتفاع eucentric واتبع ترتيب المحاذاة كما هو موضح أدناه.قم بتشغيل Auto-eucentric عن طريق إمالة المرحلة مع الإعداد المسبق ل “Eucentric Height”. قم بتشغيل روتين التركيز البؤري التلقائي باستخدام الإعداد المسبق ” التركيز البؤري “. قم بتشغيل روتين Autostigmate باستخدام الإعداد المسبق ل “Thon Ring”. قم بتشغيل روتين Autocoma باستخدام الإعداد المسبق ل “Thon Ring”. أدخل فتحة العدسة الموضوعية المطلوبة (الشكل 6B)، التي من المحتمل أن تكون فتحة العدسة 100 ميكرومتر، كحل وسط جيد لزيادة تباين العينة وقطع صغير فقط في الإشارة بدقة عالية جدا. كرر روتين الوصم التلقائي بعد إدخال فتحة العدسة.ملاحظة: عند التكبير بأحجام بكسل حوالي 3 Å ودقة أقل، قد يفشل روتين Autocoma ؛ في هذه الحالة، تحقق من مركز دوران Tomo وقم بمحاذاته ضمن المحاذاة المباشرة في واجهة مستخدم TEM. تحقق من أن روتين التمركز التلقائي بدون خسارة يعمل على عينتك. مع ضبط “صفر خسارة” مسبقا بجرعة عالية بشكل معقول (الخطوة 1.2.3) ، من المرجح أن ينجح الروتين في وظائف السيارات. إجراء جمع البيانات.لبدء الاكتساب التلقائي في علامة التبويب “التصوير المقطعي” ، حدد لوح الحصول على البيانات وقم بتعيين المعلمات المطلوبة (الشكل 7C). إعداد معلمات الحصول على البيانات: خطوة الإمالة (°)، الحد الأقصى للزاوية الإيجابية (°)، الحد الأقصى للزاوية السالبة (°)، مخطط التتبع (مستحسن: حدد المسار/التركيز البؤري قبل الاستحواذ). حدد إغلاق صمامات العمود لنظام الارتفاع eucentric.ملاحظة: نادرا ما تستخدم المعلمات هي “ضبط وقت التعرض” و “ضبط ZLP” و “استخدام لوحة المرحلة” و “الإيقاف المؤقت بعد الإمالة”.استخدم ضبط وقت التعرض للصور المقطعية غير المخصصة ل STA لزيادة وقت التعرض بنسبة محددة عند الإمالات الأعلى. سيقوم خيار ضبط ZLP بتشغيل تحسين ZLP بعد كل تصوير مقطعي ، بغض النظر عن مجموعة الدوريات. إنه بطيء ، ويفشل أحيانا دون أسباب واضحة ، وسوف يتخطى اكتساب هذا المنصب. ومع ذلك ، يمكن أن يكون مفيدا لعرض الشق الضيق للغاية ، أي 3-5 eV على مرشح Selectris(X). نادرا ما يتم استخدام لوحة الطور منذ إدخال DEDs مع مرشحات الطاقة. يؤدي الإيقاف المؤقت بعد الإمالة إلى إيقاف عملية الاستحواذ مؤقتا ولكنه لا يسمح بأي تغييرات في البرنامج. تحقق مرة أخرى من معلمات جمع البيانات (في علامة التبويب “التحضير”) ، ووافق على حساب الجرعة ومخطط الإمالة المطلوب ، وحدد عدد الكسور (Nr.) في الإعداد المسبق “التعرض” ، ثم ابدأ في الاكتساب.ملاحظة: يعتمد عدد الكسور على العينة ومعلمات الاكتساب وخطوات ما بعد المعالجة المخطط لها ، أي STA مقابل التحليل المورفولوجي ، ويجب الاحتفاظ بها إلى القيم التي يحصل فيها تصحيح الحركة وتقدير CTF على إشارة كافية. مجموعة من 4-10 كسور هو تقدير جيد ، حيث 4 أكثر ملاءمة للعينات السميكة و 10 للعينات الجزيئية الأرق.ثم انقر فوق ابدأ لبدء جمع البيانات ومراقبة أول اكتساب للتصوير المقطعي لضمان الحصول على الصور المقطعية على النحو المنشود.ملاحظة: تحتوي إصدارات برامج التصوير المقطعي الحديثة على لوح إضافي ل Movie Player في علامة التبويب “التصوير المقطعي” حيث يمكن مشاهدة الصور المقطعية المكتسبة. التحلي بالصبر أثناء عملية التحميل. 2. Cryo-ET STA من الأبوفيريتين باستخدام emClarity ملاحظة: هنا ، يتم استخدام برنامج emClarity17 لتوضيح تحديد بنية cryo-ET بواسطة STA. يلخص الشكل 9 هذه العملية. تم أخذ ستة سلاسل إمالة من الأبوفيريتين (EMPIAR-10787) كمثال. تم تطبيق التماثل ثماني الأضلاع ، وكان للخريطة النهائية دقة 2.86 Å ، تم الحصول عليها من 4800 جسيم فقط وقريبة من تردد Nyquist (2.68 Å). تأكد من تنزيل حزمة برامج emClarity39 وتثبيتها (انظر جدول المواد). تثبيت IMOD لمعالجة البرامج40.ملاحظة: المعرفة الأساسية بأوامر Linux مطلوبة. يمكن العثور على برنامج تعليمي أكثر تفصيلا في المرجع41 ، والذي يأخذ مجموعة بيانات الريبوسوم (EMPIAR-10304) كمثال ويصف الإجراءات خطوة بخطوة. بالنسبة لأنواع مختلفة من عينات البروتين ، يتوفر أيضا تقرير منشور مسبقا42. إعداد ملفات الإدخال والدلائل.ملاحظة: تم تصحيح الإطارات الخام بواسطة MotionCor2 (التصحيح 5 × 5)43 (انظر جدول المواد). تم تكديس الصور المصححة حركيا لإنشاء سلسلة الإمالة باستخدام مكدس الأخبار (IMOD) ومحاذاة يدويا مع تتبع التصحيح باستخدام Etomo (انظر جدول المواد) ، متبوعا ب emClarity. للحصول على محاذاة أفضل ، يوصى بإجراء تعويضات وتعويض إمالة في Etomo. تتم إعادة تسمية سلسلة الإمالة الستة باسم TS1 إلى TS6. فيما يلي الإرشادات والأوامر الخاصة بسلسلة الإمالة الأولى (TS1) كمثال.إنشاء مجلد مشروع.ملاحظة: أحدث إصدار من البرنامج هو 1.5.3.11. يمكن العثور على جميع سجلات البرامج ذات الصلة في مجلد المشروع المحلي (…/logFile/emClarity.logfile). ضمن مجلد المشروع ، قم بإنشاء مجلد جديد آخر ، “fixedStacks” ، وقم بإعداد ملفات الإدخال: TS1.fixed و TS1.xf و TS1.tlt.ملاحظة: TS1.fixed: سلسلة الإمالة الأصلية، والمعروفة أيضا باسم TS1.st في إيتومو. TS1.xf: يحتوي هذا الملف على إحداثيات التحويل بعد إمالة Etomo. TS1.tlt: يحتوي هذا الملف على زوايا إمالة. قم بتقدير إلغاء التركيز باتباع الخطوات أدناه.احسب إلغاء التركيز البؤري. تحديث ملف المعلمة باستخدام المجهر ومعلمات التصوير وفقا للجدول التكميلي 1. انسخ ملف معلمة إلى مجلد المشروع، وقم بتغيير اسمه إلى param_ctf.m، وقم بتشغيل: emClarity ctf param_ctf.m TS1.ملاحظة: يمكن العثور على قالب ملف المعلمة في الملف التكميلي 1 أو دليل تثبيت البرامج المحلية (…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/). تحقق من نتائج تقدير CTF لكل مكدس.تحقق من المكدسات المحاذاة (على سبيل المثال ، aliStacks / TS1_ali1.fixed) باستخدام 3dmod وتأكد من مسح الخرز الائتماني بشكل صحيح. تأكد من أن ملف السجل يبلغ عن صحة اليد ، والتي يمكن العثور عليها في logfile / emClarity.logfile (الشكل 9). تحقق من قيمة إلغاء التركيز البؤري (على سبيل المثال، fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf)، وتأكد من أنها تتطابق مع تقدير CTF النظري. تحديد المناطق الفرعية.قم بإنشاء تصوير مقطعي مجلد. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: sh recScript2.sh -1.ملاحظة: سيتم تخزين مخطط مقطعي أصغر (في الحجم) لكل مكدس في مجلد جديد “bin10”. لتسريع العملية ، يمكن تحديد إحداثيات منطقة فرعية واحدة أو عدة مناطق فرعية في تصوير مقطعي bin10. سيكون ملف البرنامج النصي في دليل تثبيت البرامج المحلي (…/emClarity_1.5.3.11/docs/). حدد الحدود عن طريق اختيار ست نقاط، x min، x max، y min، y max، zmin، zmax، z max، zmax، لإنشاء منطقة فرعية واحدة. ضمن المجلد “bin10” ، قم بتشغيل: 3dmod TS1_bin10.rec.ملاحظة: إذا كان من المقرر إنشاء أربع مناطق فرعية في سلسلة إمالة واحدة، فاختر 6 × 4 = 24 نقطة. يجب أن يحتوي كل مكدس على ملف طراز واحد (*.mod) ضمن المجلد “bin10”. تحويل ملفات النموذج إلى تنسيق emClarity. سيؤدي ذلك إلى إنشاء إعادة تشكيل مجلد جديد. قم بتخزين كافة إحداثيات كل منطقة فرعية ضمن هذا المجلد. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: sh recScript2.sh TS1. اختر الجسيمات.ابحث عن قالب أبوفيريتين لاختيار الجسيمات. قم بتنزيل قالب من بنك بيانات المجهر الإلكتروني (EMD-10101)44. تأكد من أن حجم البكسل للقالب يتطابق مع حجم البيانات الأولية. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 وحدة المعالجة المركزية. قم بإنشاء صور مقطعية مصححة بواسطة CTF لاختيار الجسيمات. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch. قم بتشغيل اختيار الجسيمات لكل منطقة فرعية. بالنسبة لمجموعة بيانات apoferritin ، قم بإجراء بحث في القالب في bin6. قم بتعديل معلمات Tmp_angleSearch (θ out، Δout، θ in، Δin) لتحديد نطاق الزاوية والفواصل الزمنية للبحث داخل المستوى أو خارجه بالدرجات. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: قالب emClarity Search param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.ملاحظة: سيتم إنشاء مجلد “convmap_wedge_Type2_bin6” في هذه الخطوة. يتضمن ملف csv ضمن هذا المجلد (على سبيل المثال، TS1_1_bin6.csv) جميع المعلومات حول الجسيمات التي تم اختيارها. إزالة الجسيمات غير الصحيحة باستخدام 3dmod. ضمن المجلد “convmap_wedge_Type2_bin6” ، قم بتشغيل: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.ملاحظة: من الشائع العثور على جزيئات خاطئة بجوار حواف الكربون أو تلوث الجليد في تلك المناطق. قم بإجراء نقرة بالماوس الأيمن على النقاط غير الصحيحة واضغط على backspace على لوحة المفاتيح لحذفها. في هذه الخطوة، تأكد من إزالة معظم النقاط الإيجابية الخاطئة (الشكل 10). قم بتغيير اسم المجلد “convmap_wedge_Type2_bin6” إلى “convmap” ، حيث سيذهب emClarity ويجد معلومات المنطقة الفرعية ضمن convmap في الخطوات التالية. تهيئة المشروع. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity init param0.m، لإنشاء قاعدة بيانات ل emClarity، ApoF.mat. قم بإجراء إعادة بناء التصوير المقطعي قبل STA والمحاذاة. لإنشاء صور مقطعية للمنطقة الفرعية مصححة من CTF في bin4 ، قم بتشغيل: emClarity ctf 3d param0.m.ملاحظة: سيتم إنشاء الصور المقطعية المصححة CTF (على سبيل المثال، ذاكرة التخزين المؤقت/TS1_1_bin4.rec)  في مجلد جديد “ذاكرة التخزين المؤقت”. أداء STA والمحاذاة.قم بإجراء المتوسط باستخدام التصوير المقطعي الفرعي المصحح بواسطة CTF بدءا من bin4. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment. استمر في إجراء المحاذاة وتشغيل: emClarity alignRaw param0.m 0.ملاحظة: تقوم خطوة المتوسط بإنشاء مرجع والذي سيتم استخدامه بواسطة emClarity في هذه الخطوة لمحاذاة الجسيمات. يمكن تغيير معلمات Raw_angleSearch (θ out ، Δout ، θ in ، Δin) لتعيين نطاق الزاوية وأحجام الخطوات لكل دورة. نظرا لإزالة معظم الجسيمات غير الصحيحة من قاعدة البيانات (الخطوة 2.6.4) ، يمكن أن تبدأ هذه الإعدادات الزاوية للمحاذاة بدرجة صغيرة نسبيا. قم بتحديث معلمات Raw_angleSearch وتشغيل بضع دورات أخرى (الخطوتان 2.9.1 و 2.9.2). لتسريع العملية، قم بإجراء محاذاة داخل الطائرة وخارجها بشكل منفصل.ملاحظة: لكل عملية ربط، يوصى بتشغيل دورات متعددة وتقليل الإعدادات الزاوية تدريجيا. وفيما يتعلق بمجموعة بيانات ApoF، أجريت خمس دورات أخرى في الصندوق 4، ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في الجدول التكميلي 2. بالنسبة إلى cycle001، في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment، متبوعا ب emClarity alignRaw param1.m 1. تنظيف الجسيمات المتداخلة. في مجلد المشروع، تشغيل: emClarity removeDuplicates param5.m 5. قم بإجراء تحسين سلسلة الإمالة باستخدام tomoCPR.ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.قم بتشغيل tomoCPR لتحسين هندسة المكدس. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity tomoCPR param5.m 5. إنشاء مكدسات محاذاة حديثا وتحديث ملفات الهندسة. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: تحديث emClarity ctf param6.m.ملاحظة: تأكد من إنشاء ملفات الهندسة الجديدة (على سبيل المثال، fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) والمكدسات المحاذاة حديثا (على سبيل المثال، aliStacks/TS1_ali2.fixed) بشكل صحيح. إنشاء صور مقطعية فرعية جديدة في bin2. في مجلد المشروع ، قم بتشغيل: emClarity ctf 3d param6.m.ملاحظة: سيتبع ذلك بضع دورات للمتوسط والمحاذاة عند bin2 (الخطوات 2.9.1 و2.9.2 و2.9.3) والتنظيف المكرر (الخطوة 2.9.4) وtomoCPR الاختياري (الخطوة 2.10). بسبب التماثل العالي ، تم تنفيذ خمس دورات أخرى في bin2 للأبوفيريتين. تحديث معلمات Raw_angleSearch لكل دورة. إجراء إعادة الإعمار النهائي.استمر في تشغيل بضع دورات في bin1 و tomoCPR (الخطوة 2.9 والخطوة 2.10). تم إجراء 10 دورات أخرى في bin1 لمجموعة بيانات أبوفيريتين. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل المتعلقة بالأوامر والمعلمات في الجدول 2. قم بإجراء إعادة الإعمار النهائية من خلال الجمع بين مجموعتي البيانات النصفيتين. في مجلد المشروع، قم بتشغيل: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment، متبوعا ب emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.ملاحظة: سيتم إنشاء الخريطة النهائية (على سبيل المثال، مع عامل B من 10، cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc)، الشكل 11.

Representative Results

بالنسبة للعينات الخلوية والصفائحية ، تعتمد استراتيجية جمع البيانات إلى حد كبير على العينة والهدف من دراسة التصوير (الشكل 1). يعتمد نهج الاستهداف على ما إذا كان الهدف الجزيئي في الموقع أو محضرا من المجمع الجزيئي الكبير المنقى لعينات إعادة البناء عالية الدقة التي تحتوي على أهداف جزيئية. بالنسبة للمجمعات النقية المزججة على شبكات هولي (الكربون) ، يمكن أن يعتمد الاستهداف ببساطة على التصوير في ثقوب فيلم الدعم (الكربون). بالنسبة للعمل في الموقع ، يتطلب نهج الاستهداف معرفة موقع الكيان الجزيئي استنادا إلى البيانات المرتبطة أو المعالم الخلوية المعروفة منخفضة التكبير. من الناحية المثالية ، يمكن التعرف على المعالم الخلوية عند التقاط صور عامة ، وإذا كانت كافية لتوطين المناطق ذات الاهتمام تقريبا ، فيمكنها توفير طريقة سريعة لتأكيد الهوية المستهدفة باستخدام صورة بحث. ومع ذلك ، إذا كانت الأحداث التي يمكن ملاحظتها نادرة ، فقد تكون هناك حاجة إلى صور بحث تكبير متوسطة لتأهيل الهدف بشكل صحيح. خرائط البحث هي مونتاج تكبير متوسط لصور البحث ، وبالتالي ، يمكن أن تجعل العثور على الهدف أسهل بكثير ، حيث يمكن الحصول عليها عند التكبير الذي تكون فيه ميزة الاهتمام مرئية. يمكن بعد ذلك فحص خرائط البحث للعثور على مواضع الدفعات المستهدفة وإعدادها. وبالنسبة للعينات التي تحتوي على سمات خلوية لإعادة البناء فوق الهيكلي، فإن نهج الاستهداف متشابه، وإن كان يعتمد بنفس القدر على رؤية الحدث الخلوي عند تكبيرات مختلفة وانتشاره في العينة. ويجب أيضا النظر في استراتيجية الحصول على البيانات؛ في جميع الحالات ، يحدد هدف الدراسة إلى حد كبير كيفية جمع البيانات. لإعادة بناء البنية الفائقة الخلوية ، قد يكون التكبير المنخفض (20-5 Å / px) ومجال الرؤية الكبير مناسبا ، ولكن هناك حاجة إلى تكبيرات عالية لإعادة بناء التفاصيل الجزيئية أو عالية الدقة (5-1 Å / px). ولن تتمكن مجموعة البيانات التي يتم جمعها عند 1.5 Å/px إلا من إنتاج إعادة بناء عند تردد Nyquist البالغ 3.0 Å/px؛ ومع ذلك ، في الواقع ، تؤثر العديد من العوامل ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر سمك العينة وحجمها وعدم تجانس ، على جودة إعادة الإعمار التي تم الحصول عليها. توازن معلمات التصوير الدقيقة أيضا بين التكبير بناء على هدف الدراسة ومجال الرؤية لاحتواء معلومات كافية. تقدم هذه المقالة حالة تحت التصوير المقطعي يصل متوسطها إلى 2.86 Å ، ولكن يتم عرض دراسات إضافية 17,42,43,44,45 في الجدول 1 لتوضيح معلمات الجمع المرتبطة بالدراسات التي تستهدف نتائج مختلفة 17,42,45,46. بمجرد إنشاء سير عمل مستهدف ونظام للحصول على البيانات ل cryo-ET ، يمكن جمع البيانات من العديد من أنواع العينات المختلفة. يتم عرض الصور المقطعية التمثيلية لمجموعة متنوعة من العينات هنا: عينات جزيئية مثل الأبوفيريتين (الفيلم 1) ، والعمليات الخلوية الرقيقة (الفيلم 2) ، والصفائح المطحونة FIB للعينة الخلوية السميكة (الفيلم 3). الشكل 1: نظرة عامة على إعداد سير عمل التصوير المقطعي. يتم عرض سير عمل التصوير cryo-ET الموضح في البروتوكول كمخطط انسيابي. يتم عرض الصور المتوقع الحصول عليها لسير العمل الخلوي والجزيئي. تتبع التسمية المقدمة اتفاقية Tomo5 ، على الرغم من أن معظم برامج اقتناء التصوير المقطعي تشترك في مبادئ مشتركة لجمع هذه الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: علامة تبويب التحضير وشروط البحث المعدة مسبقا . (أ) صورة نظرة عامة لعلامة التبويب بأكملها. يتم تعيين الإعدادات المسبقة لحالة التصوير في علامة التبويب هذه، ويمكن العثور على “معايرة Image Shift” و “إعدادات تصفية الصور” في القائمة المنسدلة “المهام”. (ب) تكبير القائمة المنسدلة “الإعدادات المسبقة” حيث يمكن تحديد كل إعداد مسبق لإعداد ظروف التصوير الفردية. (ج) صورة تصور تكبيرا كافيا لتناسب كل من التعريض الضوئي ومنطقة “التركيز البؤري والتتبع” في مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: حسابات الجرعات. مثال على حسابات الجرعة لمخططات اقتناء التصوير المقطعي المحتملة حيث تم قياس معدل الجرعة على الفراغ. يحدد الحسابان وقت (وقت) التعرض لكل إمالة، سواء كان استهداف جرعة مثالية لكل إمالة أو جرعة إجمالية مثالية لسلسلة الإمالة الكاملة. في المتوسط تحت التصوير المقطعي ، من الشائع استهداف جرعة مثالية لكل صورة مائلة في نطاق 3.0-3.5 e-/Å2. في كلتا الحالتين ، يتم تعيين “الكسور (Nr.)” إلى 6 لتحقيق ~ 0.5 e-/Å2 من الجرعة لكل إطار فيلم من الميل للحصول على إشارة كافية لإجراء تصحيح الحركة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: علامة التبويب أطلس. صورة نظرة عامة على علامة التبويب “أطلس”. تم اقتصاص الصورة لتجنب مساحات موضع الشبكة الفارغة. تحتوي قائمة “المهام” على تفضيلات إعداد الجلسة ومساحات تحديد الشبكة للتحديد الفردي لجميع الشبكات التي تم جردها وخيار الحصول على أطلس واحد بعد إزالة الكاسيت من المحمل التلقائي. يمكن إعادة تعيين الشبكة المحددة ثم إعادة اكتسابها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تحولات الصورة المعايرة. صورة تصور صورة التعرض والبحث. الصليب الأحمر في صورة البحث هو العلامة المتحولة لتصحيح الإزاحة بين التعرض والبحث. يجب على المرء إعادة معايرة إزاحة الصورة عند بدء الجلسة أو بعد تغيير الإعدادات المسبقة لحالة التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: الوظائف والفتحات التلقائية. (أ) تصور علامة التبويب “الوظائف التلقائية” القائمة المنسدلة “الإعدادات المسبقة” وتحديد “المهمة”. يوجد تحته خط باللون الأزرق هو الإعداد المسبق “Thon Ring” المطلوب ل “Autostigmate” (مسطر أيضا باللون الأزرق) و “Autocoma”. يجب على المرء تحديد الإعدادات المسبقة لكل مهمة ثم الضغط على زر ابدأ . (ب) توجد الفتحات في واجهة مستخدم TEM. حدد “فتحة العدسة الموضوعية” المطلوبة بعد تنفيذ الوظائف التلقائية وقم بتشغيل “Autostigmate” مع فتحة العدسة . الشكل 7: نظرة عامة على علامة تبويب التصوير المقطعي. تظهر الصور واجهة مستخدم Tomo 5.8. (أ) مواقف الدفعات. أحدث الوظائف الموضحة في الصورة: خيار “الحصول على خريطة البحث” ؛ يتم عرض مواضع التصوير المقطعي في عرض أطلس مع خيار التكبير/التصغير. تم تمييزه في أعلى اليمين هو “تحديد المواقف” ؛ أدناه تم اختيار جميع المواقف الأربعة لمعلمات “تحديث إلغاء التركيز”. (ب) يتم اختيار ثلاثة مواضع على خريطة البحث، تحمل العلامات 1 و2 و3. لن يشكل الموضع 1 مشكلة عند تشغيل “تحسين الكل”. ومع ذلك ، إذا كان في إعداد كثافة مستهدفة عالية مثل عندما يتم تحديد مواضع الصفائح ، كما هو موضح للموضع 2 والموضع 3 ، فإن “تحسين الكل” سيقوم بتشغيل روتين “التتبع” و “التركيز” على منطقة “التعرض” من الموضع 2 ، مما يعرض الهدف قبل الحصول على التصوير المقطعي. نوع الشبكة هو R1.2/1.3. شريط المقياس = 1.2 ميكرومتر (C) الحصول على البيانات. يمكن الآن الحصول على إعداد المراكز المحددة في “مراكز الدفعات” بشكل فردي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: تحديد الحد الأقصى لزاوية الإمالة. يصور الشكل نهجا خطوة بخطوة لتحديد الحد الأقصى لنطاق الإمالة لعمليات الاستحواذ على التصوير المقطعي. (أ) نظرة عامة بزاوية 0 درجة وخريطة بحث في وسط مربع الشبكة. لاختبار نطاق الإمالة، يمكن ضبط الزاوية في برنامج التصوير المقطعي باستخدام “Set Tilt (°)” عن طريق كتابة القيمة المطلوبة ثم الضغط على Set. (ب) تم إمالة المرحلة إلى -60 درجة، مما يدل على أن زاوية من خريطة البحث لن يتم الحصول عليها بالكامل عند -60 درجة. (ج) تم إمالة المرحلة إلى 60 درجة. من خلال حساب الثقوب التي اختفت عند ±60 درجة ، يمكن للمرء أن يحصل على فكرة عن نطاق الميل لمربع الشبكة. أشرطة المقياس = 2.5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: مخطط انسيابي emClarity. وصف المخطط الانسيابي الخطوات المختلفة لمتوسط التصوير المقطعي الفرعي للتبريد. أشرطة المقياس = 50 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: مطابقة القالب باستخدام emClarity . (A) رسم مجهري نموذجي للأبوفيريتين على شبكة مغلفة بالجرافين. إلغاء التركيز البؤري: −3.430 ميكرومتر (B) شريحة من التصوير المقطعي متراكبة مع نقاط النموذج بعد البحث في القالب. (ج) أعلى و (د) منظر جانبي لنقاط النموذج، مما يشير إلى طبقة مسطحة واحدة من جسيمات الأوفريتين أحادية التشتت. أشرطة المقياس = 50 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 11: Cryo-ET STA من apoferritin . (A) الخريطة النهائية بعد 21 دورة من محاذاة التصوير المقطعي الفرعي. (ب) مخطط ارتباط قذيفة فورييه (FSC) للخريطة النهائية بدقة أبلغ عنها تبلغ 2.86 Å ، تحتوي على 38 FSCs مخروطية. (C) خرائط كثافة تمثيلية (مزودة بنموذج PDB 6s6147). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. عينة نوع Cryo-ET Å/px نطاق الإمالة (+/-) خطوة الإمالة (°) نطاق إلغاء التركيز البؤري (ميكرومتر) الجرعة الإجمالية (e-/Å2) دقة البيانات الأولية مرجع أبوفيريتين منقى/جزيئي (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 امبيار-10787 17 وهذه الورقة هفوة فيروس نقص المناعة البشرية-1 منقى/جزيئي (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 إمبيار-10164 17 الريبوسوم منقى/جزيئي (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 امبيار-10304 42 ارتفاع SARS-CoV-2 الصفيحة / الجزيئية (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 إمبيار-10753 45 بنية محور عصبي عصبي الخلوية (فوق الهيكلية) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 ن.د. إمبيار-10922 47 الجدول 1: معلمات التجميع للعديد من دراسات cryo-ET. دراسات تستهدف إعادة بناء التفاصيل الجزيئية من البروتينات النقية أو في الموقع مقارنة بدراسة تهدف إلى حل وتقسيم الميزات الخلوية فوق الهيكلية. الفيلم 1: تصوير مقطعي لعينات أبوفيريتين على شبكة EM عادية ثم يتم تصويرها باستخدام تبريد TEM مزود بكاميرا فائقة الدقة مع مرشح متوافق. تم الحصول على سلسلة الإمالة بمخطط متماثل للجرعة ، مع امتداد إمالة يبلغ 54 درجة وجرعة إجمالية قدرها 134 e-/A2 في برنامج التصوير المقطعي الإلكتروني. شريط المقياس = 50 نانومتر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم. الفيلم 2: تصوير مقطعي لخلية عصبية أولية نمت على شبكة EM ثم تم تصويرها مباشرة باستخدام جهاز تبريد TEM مجهز بكاميرا فائقة الدقة مزودة بمرشح متوافق. تم الحصول على سلسلة الإمالة بمخطط متماثل للجرعة ، مع امتداد إمالة يبلغ 60 درجة وجرعة إجمالية قدرها 120 e-/A2 في برنامج التصوير المقطعي الإلكتروني. شريط المقياس = 100 نانومتر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم. الفيلم 3: تصوير مقطعي للبكتيريا الزرقاء على شبكة EM ، يخضع لطحن FIB ثم يتم تصويره باستخدام TEM مبرد مجهز بكاميرا عالية السرعة ومرشح متوافق. تم الحصول على سلسلة الإمالة بمخطط متماثل للجرعة ، مع امتداد إمالة يبلغ 50 درجة وجرعة إجمالية قدرها 120 e-/A2 في برنامج التصوير المقطعي الإلكتروني. شريط المقياس = 87.2 نانومتر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم. الملف التكميلي 1: قالب ملف المعلمة لتقدير إلغاء التركيز. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي 1: جمع البيانات وتفاصيل إعداد المجهر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الجدول التكميلي 2: قائمة الأوامر حسب ترتيب التنفيذ. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

تومو5
يسلط وصف سير العمل لبرنامج التصوير المقطعي الضوء على إحدى الطرق المحتملة والأكثر انسيابية لإعداد جلسة التصوير المقطعي الدفعي (عن بعد). على الرغم من أن البرنامج سهل للمبتدئين ، إلا أن بعض تجارب cryo-EM الأولية وفهم التصوير المقطعي الأساسي يمكن أن يساعد في الإعداد. يتم تمييز الخطوات الهامة في البروتوكول ويجب أن تساعد في استكشاف الأخطاء وإصلاحها حتى في حالة استخدام نهج إعداد مختلف. سيؤدي تقدم البرنامج إلى تسهيل جمع البيانات (عن بعد) وجعل cryo-ET أكثر سهولة لقاعدة واسعة من المستخدمين. فيما يلي بعض النصائح والحيل التي يمكن أن تساعد في استكشاف المشكلات التي تتم مواجهتها بشكل شائع وإصلاحها.

إحدى النقاط المهمة التي يجب مناقشتها هي اختيار الشبكات لأنه عند إمالة العينة إلى ±60 درجة ، يمكن لقضبان الشبكة عند الإمالات العالية أن تحجب الرؤية (الشكل 8). على شبكة TEM ، يشير حجم الشبكة إلى عدد مربعات الشبكة لكل وحدة طول الشبكة. تحتوي أرقام الشبكات الأكبر على مربعات شبكة أكبر لكل طول وحدة ، وكثافة أعلى من مربعات الشبكة ، ومربعات شبكة أصغر ، أي أن الشبكة المكونة من 400 شبكة تحتوي على مربعات أصغر من شبكة 200. اختيار جيد للشبكات للتصوير المقطعي هو شبكة 200 أو 300 شبكة. كما هو موضح في الشكل 8 ، يتم تقليل المساحة المتاحة للجمع مع إمالة الشبكة. عند إمالة ±60 درجة ، سيكون لشبكة 300 شبكة مجال رؤية صغير يمكن من خلاله الحصول على تصوير طيني كامل. تتمثل مزايا الشبكات المكونة من 200 شبكة في أن مربعات الشبكة الأكبر تجعل إعداد التصوير المقطعي الجزيئي أسرع ، ومع زيادة مساحة مربع الشبكة ، من المرجح أن يكون مربع واحد كافيا لجمع بين عشية وضحاها. العيب هو أن الشبكات ذات 200 شبكة أكثر هشاشة ، لذا فإن المناولة والقطع يتطلبان المزيد من الدقة.

علاوة على ذلك ، في حالة استخدام فيلم دعم holey (انظر جدول المواد) على شبكات EM ، يجب مراعاة تباعد الثقوب لإعداد منطقة التركيز والتتبع فيما يتعلق بمنطقة التعرض. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون قطر الشعاع عند التكبير المطلوب صغيرا بما يكفي لتغطية منطقة الكربون المجاورة لمنطقة التعرض على طول محور الإمالة للإعداد الأمثل والسريع. بهذه الطريقة ، يمكن الحصول على المناطق المحتملة ذات الأهمية في كل حفرة.

نظرا لأن روتين الارتفاع المتمركز حول eucentric الخاص بالبرنامج ليس قويا حاليا ، مثل روتين serialEM ، يمكن أن تعمل النصائح التالية على حل هذه المشكلة. إذا فشل تحديد الارتفاع eucentric باستخدام الإعداد المسبق للارتفاع eucentric ، فيمكن للمرء استخدام الإعداد المسبق للنظرة العامة بدلا من ذلك وإعادة تشغيل “Auto-eucentric by stage tilt” ؛ هذا يمكن أن يحل المشكلات إذا كان ارتفاع eucentric بعيدا عن 0. إذا نجح ذلك ، فيمكن للمرء إعادة تشغيل “Auto-eucentric by stage tilt” مع الإعدادات المسبقة “Eucentric Height” لتحسين الدقة. إذا فشلت ، يمكن للمرء تشغيل “Auto-Eucentric by beam tilt” مع الإعداد المسبق لارتفاع eucentric ثم إعادة تشغيل “Auto-Eucentric by stage tilt” أو تعيين ارتفاع z يدويا المدمجين بواسطة “Auto-Eucentric by beam tilt” في واجهة مستخدم TEM ضمن إعدادات “المرحلة”. في حالة استخدام شبكات ذات نمط متكرر من الثقوب ، فقد تمنع تحديد ذروة ارتباط متقاطعة واحدة. يمكن للمرء أن يحاول تغيير الإعداد المسبق للارتفاع eucentric إلى إزاحة أقل لإلغاء التركيز البؤري مثل -25 ميكرومتر و / أو وقت تعرض أقصر لتقليل الارتباط المتبادل من أنماط الثقوب. من ناحية أخرى ، قد لا يوفر استخدام شبكات / صفيحة الدانتيل إشارة كافية لذروة ارتباط متقاطعة قوية. يمكن للمرء أن يحاول تغيير الإعداد المسبق للارتفاع المركزي إلى إزاحة أكبر لإلغاء التركيز البؤري مثل -75 ميكرومتر و / أو وقت التعرض الممتد لتعزيز ذروة الارتباط المتقاطع. خيار آخر هو ضبط إعدادات مرشح الصورة. يمكن العثور عليها في علامة التبويب “التحضير”. يمكن تعيين خيارات ضبط إعدادات المرشح للانخفاض (نظرة عامة/Gridsquare)، والمتوسط (الارتفاع Eucentric)، والتكبير العالي (التتبع/التركيز البؤري) للعثور على ذروة الارتباط المتبادل المثلى لكل إعداد مسبق. الإدخال المطلوب هو صورة واحدة ، أي عند 0 درجة وواحدة عند 5 درجات ، متبوعة بالنقر فوق مقارنة لمقارنة كلتا الصورتين. قيمة البدء الموصى بها لأطول طول موجي هي ربع شريط المقياس في الصورة ولأقصر طول موجي هو واحد من أربعين من شريط المقياس. إذا لم يتم تحديد الذروة بقوة ، فيمكن للمرء تحسين الإعدادات حتى يمكن العثور على ذروة مقنعة. ليست هناك حاجة لإعادة الحصول على الصور في كل مرة. ببساطة الضغط على “مقارنة” يكفي. إذا كان TOMO لا يزال يفشل في العثور تلقائيا على الارتفاع eucentric ، فيمكن استخدام معايرة الارتفاع اليدوي eucentric. يجب على المرء أن يتمركز فوق بلورة ثلج كبيرة بشكل معقول في تكبير النظرة العامة في علامة التبويب “التحضير” ، ثم انتقل إلى “التحكم في المرحلة” لواجهة مستخدم TEM ، واضبط ألفا على -30 درجة ، واضبط قيمة المرحلة z لإعادة توسيط البلورة باستخدام صورة شاشة الفلورسنت. إن تحديد إعدادات “الدقة العالية” و “التباين العالي” في واجهة مستخدم TEM سيجعل هذا الأمر بسيطا (أزرار في أسفل نافذة شاشة الفلورسنت). اختياريا ، إذا كان هناك وصول إلى كاميرا ذات وضع مباشر ، فيمكن استخدام ذلك لتحديد الارتفاع المركزي ؛ سيكون أسهل من شاشة الفلورسنت.

أكبر القيود في إصدارات Tomo5 قبل 5.8 هي مونتاج التكبير المتوسط المفقود ، والمخطط المتماثل للجرعة المفقودة ، والمشاكل المتعلقة بالعثور على ارتفاع eucentric. هذه موجودة في serialEM ، وهي برامج مجانية مع التطوير السريع ودعم المجتمع ، وروتين ارتفاع قوي eucentric ، وخيار الكتابة ، أي مخطط متماثل للجرعة مصمم خصيصا. من الإصدار 5.8 فصاعدا في Tomo5 ، تم حل المشكلة الأكثر شيوعا للعثور على الارتفاع eucentric ، أي حلقة غير ناجحة حول قيمة z المستهدفة ، من خلال تنفيذ خيار تعيين معيار قبول الارتفاع eucentric. ومع ذلك ، مع اختلاف أنواع الشبكات والعينات ، يوصى بشدة بضبط إعدادات مرشح الصورة لتعكس ظروف التصوير الفريدة للجلسات الفردية ولإعطاء أفضل ذروة ارتباط متقاطعة ممكنة للعثور على الارتفاع eucentric ولكي تعمل منطقة التركيز والتتبع بشكل موثوق أثناء الحصول على التصوير المقطعي.

وبشكل عام، تكيفت العديد من المرافق بسرعة مع التشغيل عن بعد خلال الوباء. يوفر برنامج Tomo5 وصولا سهلا وطريقا سهل الاستخدام إلى التصوير المقطعي وهو مناسب تماما للتشغيل عن بعد. ومما لا شك فيه أن التقدم المحرز في البرنامج سيستمر في جعل جمع البيانات عن بعد وجمع التصوير المقطعي بشكل عام أكثر شيوعا في المجتمع.

إمالوضوح
نظرا لأن emClarity يستخدم طريقة اختيار الجسيمات المستندة إلى القالب ، فإنه يحتاج إلى قالب للكائن محل الاهتمام. اختيار الجسيمات (الخطوة 2.6) حساس للغاية ومفتاح البنية النهائية. قبل المتوسط والمحاذاة (الخطوة 2.9) ، يجب على المرء التأكد من التحقق بعناية وإزالة الإيجابيات الخاطئة يدويا. عندما لا يكون القالب متاحا، قد لا يكون emClarity سهل الاستخدام، ولكن من الممكن استخدام برامج أخرى، على سبيل المثال، Dynamo37 وPEET48، لإنشاء نموذج أولي.

بالنسبة للعينات غير المتجانسة ، تم تجهيز emClarity بطريقة تصنيف تمكن المستخدمين من التركيز على ميزات محددة بمقاييس مختلفة. من المفيد تشغيل بضع دورات من المحاذاة قبل التصنيف وتشغيلها في حاوية أعلى (مثل bin 4 أو bin 3).

يحتوي الإصدار المحدث من البرنامج (V1.5.3.11) على تحديثات مهمة مقارنة بالإصدار الأول (V1.0)17. وتشمل هذه ، على سبيل المثال لا الحصر ، فحص اليد أثناء تقدير CTF (الخطوة 2.3) ؛ تناظر المحاذاة (CX ، I ، I2 ، O) ؛ حساب وظائف أخذ العينات ثلاثية الأبعاد لكل جسيم (3DSF) ؛ التبديل إلى MATLAB 2019a للتوافق والاستقرار ؛ وإعادة الإعمار باستخدام صور الإسقاط الخام (cisTEM). سيستمر البرنامج في التحسن لعينات مختلفة ، ويمكن العثور على أحدث الإعلانات عبر الإنترنت (انظر جدول المواد).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نعترف بمصدر ضوء الماس للوصول إلى مرافق cryo-EM ودعمها في المركز الوطني للتصوير الحيوي الإلكتروني في المملكة المتحدة (eBIC) ، بتمويل من Wellcome Trust و MRC و BBRSC. نود أيضا أن نشكر أندرو هاو على اقتناء التصوير المقطعي Apoferritin (الفيلم 1) ، و Ishika Kumar لإعداد واقتناء التصوير المقطعي للخلايا العصبية (الفيلم 2) ، و Craig MacGregor-Chatwin ل Cyanobacteria lamella-tomogram (الفيلم 3).

Materials

Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG – Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil – A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan –
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific –
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ – – Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ – – Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial – – Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software – – Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki – – Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461 (2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -. T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. . The IMOD Home Page Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020)
  41. . GitHub: emClarity-tutorial Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021)
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. . MotionCor2 Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016)
  44. . Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022)
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  47. . Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019)
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Tags

Cryo-electron TomographyRemote Data CollectionSubtomogram AveragingCROWETMicromoleculesNative Cellular EnvironmentTomo Five SoftwareImage Acquisition ParametersAtlasScreeningTarget SetupImage Shift CalibrationEucentric Height AdjustmentLow Dose Tomography Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image