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Biology

Cryotomographie électronique Collecte de données à distance et moyenne par sous-tomogramme

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63923
, , ,
1Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics,University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute,University of Oxford

Summary

Le présent protocole décrit l’acquisition à distance de données par cryotomographie électronique à haute résolution à l’aide de Tomo5, ainsi que le traitement ultérieur des données et la moyenne des sous-tomogrammes à l’aide d’emClarity. L’apoferritine est utilisée comme exemple pour illustrer des processus détaillés étape par étape pour obtenir une structure cryo-ET à une résolution de 2,86 Å.

Abstract

La cryotomographie électronique (cryo-ET) a pris de l’ampleur ces dernières années, en particulier depuis l’introduction des détecteurs d’électrons directs, des stratégies d’acquisition automatisées améliorées, des techniques préparatoires qui élargissent les possibilités de ce que le microscope électronique peut imager à haute résolution à l’aide de cryo-ET et un nouveau logiciel de moyenne de sous-tomogrammes. De plus, l’acquisition de données est devenue de plus en plus rationalisée, ce qui la rend plus accessible à de nombreux utilisateurs. La pandémie de SRAS-CoV-2 a encore accéléré la collecte de données de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à distance, en particulier pour la cryo-EM à particule unique, dans de nombreuses installations dans le monde, offrant aux utilisateurs un accès ininterrompu à des instruments de pointe pendant la pandémie. Avec les progrès récents de Tomo5 (logiciel de tomographie électronique 3D), la collecte de données cryo-ET à distance est devenue robuste et facile à manipuler de n’importe où dans le monde. Cet article vise à fournir une procédure détaillée, à partir de la configuration de la collecte de données dans le logiciel de tomographie pour le processus d’une session de collecte de données cryo-ET (à distance) avec dépannage détaillé. Le protocole de collecte de données (à distance) est complété par le flux de travail pour la détermination de la structure à une résolution quasi atomique par sous-tomogramme moyennant avec emClarity, en utilisant l’apoferritine comme exemple.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) est largement connue pour avoir connu une période de renaissance, l’accélérant pour devenir un outil central et central en biologie structurale. Le développement et l’utilisation de détecteurs d’électrons directs 1,2,3, l’amélioration des microscopes et des sources d’électrons 3,4,5, l’amélioration de l’automatisation et du débit 6,7,8,9 et les progrès informatiques de l’analyse monoparticulaire10,11,12,13 ,14 et la tomographie15,16,17 sont tous, en partie, responsables du succès récent de la technique. Ces moteurs technologiques ont développé la capacité de cryo-EM à résoudre des structures macromoléculaires biologiques dans des conditions cryogéniques et natives. Les résolutions facilement réalisables sont suffisantes pour une modélisation atomiquement précise et ont amené la technique à l’avant-garde de l’arène de la biologie structurale. Une approche réductionniste pour exprimer et purifier une cible biologique d’intérêt a depuis longtemps fait ses preuves en cristallographie macromoléculaire (MX) pour la recherche biologique fondamentale, la découverte de médicaments et la science translationnelle. Dans la même approche, cryo-EM peut désormais fournir des résultats parallèles aux études MX haute résolution. Le succès majeur actuel dans la branche cryo-EM de la biologie structurale est appelé analyse monoparticulaire (SPA), qui acquiert des images de projection 2D typiquement d’un échantillon de protéine purifiée18 pour obtenir des milliers de vues d’une macromolécule biologique19. Ces images (1) contiennent des informations provenant d’une gamme de vues qui représentent pleinement les orientations de la cible dans l’espace 3D et (2) capturent l’hétérogénéité conformationnelle de l’objet, qui peut ensuite être séparée et étudiée.

Une approche alternative à l’acquisition de ces images de projection 2D d’échantillons biologiques, même in situ et sans purification, est la cryo-tomographie électronique (cryo-ET). Cryo-ET prend une série d’images du même objet à des angles inclinés en faisant tourner mécaniquement l’échantillon. Ainsi, les projections 2D recueillies en SPA, représentant les poses angulaires de la molécule d’intérêt, sont intrinsèquement collectées dans le cadre de l’expérience d’imagerie cryo-ET20. Les séries d’inclinaison tomographique sont ensuite reconstruites en un tomogramme contenant des représentations 3D des complexes macromoléculaires imagés. La nature de la collecte de données tomographiques diminue, dans une certaine mesure, la dépendance à l’égard de la moyenne pour obtenir une représentation 3D complète d’une molécule à partir d’une collection d’images 2D. Cependant, en raison de la conception des scènes actuelles, l’échantillon est généralement incliné de -60° à +60°, laissant un coinmanquant 21 d’informations dans la reconstruction tomographique 3D.

Les reconstructions 3D dans un seul tomogramme ont alors un coin d’information manquant et un faible signal au bruit. Les macromolécules individuelles peuvent être extraites sous forme de sous-tomogrammes et moyennées ensemble pour résoudre ce problème. Lorsque chaque macromolécule d’un sous-tomogramme se trouve dans une orientation différente, le coin manquant est orienté différemment dans chaque sous-tomogramme de l’objet cible, de sorte qu’une moyenne sur plusieurs copies remplit les informations en raison du coin manquant. Les développements récents dans le traitement d’images ont également tenté de former des réseaux neuronaux d’intelligence artificielle pour combler le coin manquant avec des données significatives22. Ce processus de moyenne augmente également le signal au bruit, semblable à l’objectif de moyenne dans l’analyse de particules uniques, de sorte que la qualité et la résolution de la reconstruction s’améliorent. Si la molécule d’intérêt possède une symétrie, cela aussi peut être défini et utilisé lors de la moyenne, améliorant encore la résolution de la reconstruction. L’extraction de volumes 3D d’une macromolécule d’un tomogramme dans un ensemble de sous-tomogrammes et leur traitement ultérieur sont connus sous le nom de moyenne des sous-tomogrammes (STA)23. Lorsque chaque sous-tomogramme représente une copie unique de la molécule étudiée, toute hétérogénéité structurelle peut être interrogée à l’aide du flux de travail STA. Comme couramment utilisé dans le flux de travail SPA, les techniques de classification peuvent être utilisées pendant STA pour disséquer les états conformationnels du complexe d’intérêt. En plus de STA permettant une reconstruction à haute résolution en cryo-ET, cette approche fait de la technique un outil puissant pour interroger les mécanismes structurels des macromolécules dans leur environnement cellulaire natif ou de cibles souvent non sensibles au SPA24,25,26.

La tomographie électronique a une longue histoire de détermination de l’ultrastructure 3D d’échantillons cellulaires à température ambiante27. L’acquisition de vues par inclinaison physique de l’échantillon fournit suffisamment d’informations pour la reconstruction 3D d’un objet à des échelles de longueur cellulaire et est particulièrement importante lorsque les structures cellulaires n’ont pas la régularité nécessaire pour faire la moyenne. Les cellules peuvent également être congelées sur des substrats pour l’imagerie cryo-ET aux bords cellulaires où l’échantillon est suffisamment mince pour être transparent aux électrons. Dans ces conditions, STA peut être utilisé pour déterminer des structures macromoléculaires dans un environnement cellulaire, mais lorsque l’échantillon est suffisamment mince pour être transparent aux électrons28. Cependant, lorsqu’il est combiné avec d’autres techniques de préparation, y compris la cryo-corrélation de la lumière et la microscopie électronique (cryo-CLEM) et le broyage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB), le cryo-ET peut être utilisé pour imager à l’intérieur de cellules entières dans des conditions cryogéniques29. Cela réunit la puissance de cryo-ET pour étudier l’ultrastructure cellulaire avec la puissance de STA pour déterminer les structures des complexes macromoléculaires in situ tout en identifiant leur emplacement cellulaire30 et en fournissant des instantanés de complexes engagés dans des processus dynamiques31. La capacité de la technique à imager des spécimens cellulaires et à utiliser STA dans plusieurs études a mis en évidence la puissance de la technique pour résoudre des structures macromoléculaires in situ, même à des résolutions comparables à SPA32. Un autre avantage réside dans la connaissance de l’emplacement d’origine de la macromolécule, représentée par la reconstruction 3D finale classée dans le tomogramme30. Par conséquent, la structure macromoléculaire peut être corrélée avec l’ultrastructure cellulaire. Ces observations sur des échelles de longueur conduiront probablement à des résultats importants où les mécanismes structurels peuvent être corrélés avec les changements cellulaires dans le contexte des études fonctionnelles.

Cryo-ET et STA permettent la collecte de données dans trois flux de travail principaux : moléculaire, cellulaire et tomographie lamellaire. Les structures des complexes macromoléculaires purifiés peuvent être déterminées par cryo-ET par tomographie moléculaire. La détermination des structures protéiques dans leur environnement cellulaire où la cellule est suffisamment mince peut être décrite comme la tomographie cellulaire. Plus récemment, avec le développement du ciblage cryogénique et du broyage, ces mêmes techniques peuvent être appliquées dans les flux de travail de tomographie lamellaire pour déterminer les structures protéiques profondément à l’intérieur de la cellule dans leur environnement natif tout en révélant le contexte cellulaire dans lequel ces protéines sont observées. Différentes stratégies de collecte de données peuvent être utilisées en fonction des progiciels disponibles et, surtout, en fonction des exigences du spécimen. Les échantillons moléculaires ou non adhérents sur une grille TEM en cuivre d’une protéine purifiée nécessitent généralement moins de manipulation et, par conséquent, restent plats et intacts dans les cas idéaux. Les tomogrammes électroniques peuvent facilement être configurés en série sur une grille de carbone troué pour acquérir rapidement des dizaines à des centaines de tomogrammes de manière systématique. Le moyen le plus simple pour les utilisateurs de mettre en place des échantillons de tomographie moléculaire où les protéines sont abondamment présentes sur la grille serait d’utiliser Tomo5 (logiciel de tomographie électronique 3D utilisé dans la présente étude, voir Tableau des matériaux). D’autres logiciels de tomographie tels que Leginon9 et serialEM6 sont également disponibles; Ils offrent plus d’options de configuration pour des approches plus personnalisées pour la collecte de données, mais sont plus complexes et peuvent donc être plus difficiles à naviguer, en particulier pour les utilisateurs novices en tomographie et les utilisateurs accédant à leur session à distance. Pour une installation avec une base d’utilisateurs large et diversifiée, Tomo5 est facile à utiliser dans un environnement distant et à former les utilisateurs. Pour les cellules adhérentes, les grilles nécessitent généralement plus d’étapes de manipulation, et la nécessité d’utiliser des grilles en or fragiles augmente la nécessité d’améliorer les soins dans les stratégies de manipulation et de collecte de données. Pour faciliter la recherche d’une région cellulaire d’intérêt et éviter l’occlusion de la grille elle-même à des angles d’inclinaison élevés, il est également avantageux d’utiliser des maillages plus grands, mais au prix qu’ils sont intrinsèquement plus fragiles. Pour les échantillons de lamelles, la fragilité de l’échantillon est déterminée par la qualité de la lamelle, qui peut être variable. Ces facteurs augmentent le temps de configuration et les considérations, mais l’adaptabilité et la robustesse accrues rendent Tomo5 adapté à ce type de collecte de données. Toutefois, il existe des scénarios de collecte de données spécialisés pour chaque flux de travail. BISECT et PACE-tomo (tous deux exécutés en SerialEM) introduisent la possibilité de décaler l’image de faisceau scénarisée lors de l’acquisition de la tomographie pour augmenter la vitesse de collecte du tomogramme28, en particulier en tomographie moléculaire. Les montages à grossissement moyen (MMM) dans SerialEM 6,7,33 permettent de mieux identifier et cibler avec précision les caractéristiques moléculaires dans tous les flux de travail, bien que, au moment de la rédaction, ces fonctionnalités commencent à être implémentées dans Tomo5.

Comme SPA, cryo-ET et STA deviennent de plus en plus accessibles grâce aux améliorations apportées aux logiciels d’acquisition et à une multitude de progiciels disponibles pour le sous-tomogramme avec une moyenne de 16,17,32,34,35,36,37,38. En outre, pendant la pandémie, l’accès à distance à l’instrumentation cryo-EM est devenu essentiel à la poursuite du fonctionnement des installations nationales telles que le Centre de bio-imagerie électronique (eBIC) à Diamond Light Source (DLS), au Royaume-Uni. Ces développements ont rendu le cryo-ET plus accessible et robuste pour les chercheurs souhaitant utiliser la technique. Une fois les données acquises, STA est un outil essentiel d’analyse d’objets récurrents pour obtenir une reconstruction à résolution maximale et permettre la classification de l’hétérogénéité macromoléculaire. Le protocole actuel vise à fournir une présentation détaillée de la préparation d’un microscope cryo-TEM pour la collecte de données cryo-ET et de la façon d’effectuer la moyenne des sous-tomogrammes en utilisant emClarity sur un ensemble de données de tomographie moléculaire de l’apoferritine à titre d’exemple. L’utilisation d’emClarity (logiciel pour la cryotomographie électronique à haute résolution et la moyenne des sous-tomogrammes, voir Tableau des matériaux) nécessite l’exécution de scripts à partir de la ligne de commande, de sorte qu’un niveau de familiarité avec les systèmes Linux/UNIX est supposé.

La connexion à distance dépend de l’environnement réseau de chaque institut/établissement. Chez eBIC, le système distant utilise des programmes qui permettent la collecte de données à distance sur la configuration réseau spécifique utilisée chez Diamond. La connexion à distance au microscope est facilitée par deux plates-formes : NoMachine et TeamViewer (voir Tableau des matériaux). En utilisant le programme NoMachine, l’utilisateur peut se connecter à un bureau Windows distant. Le bureau Windows distant fourni par NoMachine réside sur le même réseau que le microscope et, par conséquent, agit comme un PC de support virtuel pour le microscope. À partir du PC de support virtuel, l’utilisateur se connecte au microscope via TeamViewer fournissant un accès direct et un contrôle au PC de microscope exécutant TUI et Tomo.

Le présent protocole comprend deux parties (étape 1 et étape 2). L’étape 1 se concentre sur l’acquisition de données cryo-ET à distance à l’aide de Tomo5 (logiciel de tomographie électronique 3D). La visite guidée d’une session (à distance) capture des images à des grossissements de plus en plus élevés pour permettre à l’utilisateur de diriger le logiciel de tomographie vers des zones de spécimens pour la collecte de données tomographiques. La figure 1 résume ce processus. L’étape 2 détaille le traitement des données cryo-ET STA à l’aide d’emClarity (logiciel pour la cryotomographie électronique haute résolution et la moyenne des sous-tomogrammes). La figure 9 résume ce processus.

Le protocole est destiné à un public distant. Il suppose que la personne physiquement au microscope et au chargement des échantillons a effectué les alignements directs et pris soin du réglage de la caméra et de l’acquisition de référence. Pour ce protocole, un système de lentilles à trois condensateurs avec un chargeur automatique est supposé. Pour plus de directives détaillées sur le logiciel de tomographie, un manuel détaillé du fabricant est disponible dans le bouton Démarrer de Windows à partir duquel le logiciel a été chargé.

Protocol

Les progiciels utilisés dans cette étude sont en partie disponibles gratuitement (voir le tableau des matériaux). 1. Acquisition de données cryo-ET à distance à l’aide de Tomo5 Si le logiciel n’est pas chargé, commencez par le démarrer à partir du PC serveur TEM (voir le tableau des matières). Effectuez les vérifications initiales et configurez la condition de création d’image en sélectionnant Préréglages.Démarrez la configuration de la session en ajustant les paramètres d’acquisition d’image dans l’onglet « Préparation » sous Préréglages (Figure 2A, B).Ajustez le « grossissement de la vue d’ensemble » en fonction de la taille du carré de la grille et de la dose pour obtenir des comptes adéquats.Remarque : Si l’agrandissement approprié est inconnu pour le type de grille, revenez à cette étape après avoir chargé une grille. « Hauteur eucentrique » et « Grossissement de la recherche » peuvent être identiques. Cliquez sur Rechercher dans l’onglet « Tomographie » pour définir les positions et vous assurer que le grossissement est suffisant pour montrer la marque d’intérêt et pour s’adapter à la zone « Exposition » et « Suivi/Mise au point » dans le champ de vision (Figure 2C). Réglez « Grossissement de l’exposition » sur la taille de pixel cible souhaitée. Si cela est inconnu, établissez-le en ajustant le grossissement au champ de vision souhaité pour l’adapter à la région d’intérêt. Copiez les paramètres d’acquisition d’image (Exposition) sur tous les autres préréglages à fort grossissement (Tracking, Drift, Focus, Thon Ring, Zero Loss,). Pour ce faire, appuyez sur Régler pour régler « Exposition » sur le microscope et Get pour obtenir les « Paramètres d’exposition » sur tous les autres grossissements élevés après les avoir sélectionnés individuellement.Ajustez les temps d’exposition, en particulier pour « Focus » et « Tracking » pour donner un nombre approprié de comptes, en tenant également compte de l’épaisseur à 60°, c’est-à-dire à la fois à 0° et 60°, pour que suffisamment d’électrons traversent l’échantillon pour fournir un signal fort de corrélation croisée.REMARQUE: En tant qu’estimation, les temps d’exposition pour « Tracking » et « Focus » égaux au préréglage « Exposure » sont une bonne première mesure. Pour un exemple de calcul de dose pour le préréglage « Exposition », voir la figure 3. Définissez le temps d’exposition calculé pour le préréglage « Exposition » dans l’onglet « Préparation ». Ajustez le « Préréglage zéro perte » pour utiliser une taille de point plus brillante et plus grande (une taille de point plus grande correspond à un nombre plus petit), car cela nécessite une dose plus élevée.REMARQUE: Ce préréglage est mieux utilisé pour aligner la fente du filtre à énergie s’il est présent sur le microscope. Effectuez la collecte de l’atlas en suivant les étapes ci-dessous.Pour collecter un atlas, cliquez sur Nouvelle session dans l’onglet « Atlas », définissez les préférences de session, entrez le chemin de stockage et le format de sortie, puis appuyez sur Appliquer. Sélectionnez Screening (Figure 4), puis cochez tous les atlas à acquérir. Sélectionnez Fermer les valves collatérales pour laisser le microscope sans surveillance; Cela fermera les vannes de colonne une fois que tous les atlas sélectionnés auront été collectés. Pour démarrer la projection, appuyez sur le bouton Démarrer . Inspectez les atlas à la recherche de cibles simples ou multiples en cliquant sur la grille dans le panneau de gauche sous « Filtrage » (Figure 4), puis cliquez avec le bouton gauche de la souris et faites glisser la souris pour vous déplacer et faites défiler le curseur pour effectuer un zoom avant et arrière. Choisissez la grille pour la configuration de la cible, sélectionnez-la et cliquez sur Charger l’échantillon dans le logiciel. Pour les étalonnages de décalage d’image, continuez à utiliser l’onglet de filtrage de l’atlas pour naviguer dans la grille chargée. Trouvez une caractéristique identifiable qui sera reconnaissable à tous les préréglages de grossissement, c’est-à-dire un cristal de glace chevauchant le bord d’un trou ou une autre caractéristique reconnaissable (Figure 5). Déplacez-vous vers ce carré par un clic droit de la souris, puis « Déplacer la scène vers le carré de la grille ».REMARQUE: La scène doit être à la hauteur eucentrique pour implémenter correctement les étalonnages de décalage d’image. Effectuez l’étalonnage du décalage de l’image.Dans l’onglet « Auto Functions » (Figure 6), réglez le préréglage sur « Eucentric Height », accédez à « Auto-Eucentric by Stage Tilt » et appuyez sur Start (Hauteur eucentrique), accédez à « Auto-Eucentric by Stage Tilt » et appuyez sur Start (Démarrer). Surveillez la fenêtre d’état pour vous assurer que la recherche de la hauteur eucentrique est réussie et gardez un œil sur les images d’inclinaison positives et négatives; ils doivent être corrélés.NOTE: A partir de la version 5.8 du logiciel Tomo, le critère d’acceptation de la hauteur eucentrique peut être modifié; La valeur par défaut est 0,25 μm, et le réglage sur 0,5-0,8 μm donne plus de marge de manœuvre. Les valeurs dépendent des performances du microscope, mais il est recommandé qu’elles soient aussi petites que possible.Lorsque vous êtes à hauteur eucentrique et au point focalisé, centrez la scène sur une caractéristique. Collectez un aperçu à l’aide du préréglage « Atlas ». Définissez tous les « Préréglages » à partir de l’onglet « Préparation ». Ensuite, augmentez l’agrandissement à Vue d’ensemble > fonction centrale > Aperçu, puis répétez « Grossissement de la recherche » et, enfin, « Grossissement de l’exposition ». Si la fonction est restée centrée pendant le ciblage, ignorez les étalonnages de décalage d’image. Sinon, pour calibrer le décalage de l’image, accédez à l’onglet « Préparation », sélectionnez Calibrer le décalage de l’image et appuyez sur Démarrer (Figure 5). Cela alignera de manière itérative les grossissements inférieurs sur la fonction centrée sur le grossissement de l’exposition.REMARQUE: Si le préréglage initial « Exposition » n’est pas centré à ce stade, pour le recentrage, le logiciel utilisera le décalage d’étape pour cette étape uniquement.Appuyez sur Continuer pour le préréglage « Exposition ». L’image suivante affichée sera le « Préréglage de recherche ». Pour calibrer le décalage de l’image entre les préréglages, double-cliquez avec le bouton gauche de la souris dans l’aperçu « Rechercher » à l’endroit où se trouve le centre de l’aperçu « Exposition », puis appuyez sur Réacquérir (Figure 5). Cliquez sur Procéder pour passer à la paire de préréglages suivante.REMARQUE : Si un décalage d’image à l’agrandissement de l’atlas a été appliqué pendant cet étalonnage, assurez-vous de réacquérir l’atlas une fois l’étalonnage du décalage d’image terminé. Sélectionnez l’atlas souhaité et appuyez sur Réinitialiser la sélection dans le panneau supérieur de l’onglet « Atlas ». Confirmez et recommencez à acquérir cet atlas. Effectuez la configuration de la tomographie.Créez la configuration de collecte de données de tomographie dans l’onglet « Tomographie ».REMARQUE: Sauf indication contraire, la configuration se fait entièrement dans l’onglet « Tomographie ». Démarrez une nouvelle session. Dans « Configuration de session » pour les échantillons biologiques, choisissez Slab-like comme type d’échantillon et sélectionnez Batch and Low Dose, sélectionnez le format de sortie et le dossier de stockage, ajoutez éventuellement un destinataire d’e-mail, puis appuyez sur Appliquer.REMARQUE : Un élément de menu « Positions des lots » est maintenant disponible (Figure 7A). L’atlas actuellement chargé est automatiquement importé. « Vue d’ensemble » et « Rechercher des images » peuvent être acquis et revisités jusqu’à ce qu’une nouvelle image soit acquise. De plus, à partir de la version 5.8, des cartes de recherche de tuiles 3 x 3, 4 x 4 et 5 x 5 peuvent être acquises avec « Acquérir la carte de recherche » pour faciliter la recherche et la configuration des cibles. Ils correspondent à une version de montages de grossissement moyen. Pour configurer des cibles, allez dans la « flèche de l’Atlas », trouvez une région d’intérêt et déplacez-vous en sélectionnant les options qui apparaissent avec un clic droit de la souris. Prenez une image de vue d’ensemble pour confirmer une bonne position pour le réglage de la hauteur eucentrique, puis appuyez sur Auto Eucentric; Cela exécutera la routine Eucentric by Stage Tilt. Ensuite, réacquérez une nouvelle image de vue d’ensemble pour mettre à jour la hauteur eucentrique.REMARQUE: Le bouton « Auto Focus » ne devrait pas être nécessaire si la position est à une hauteur eucentrique. Si l’image de la hauteur eucentrique apparaît loin de la mise au point, la hauteur eucentrique n’est probablement pas correcte et doit être refaite (pour le dépannage de la hauteur eucentrique, voir la section discussion). Vérifiez la cible à l’aide du préréglage « Vue d’ensemble » avant de configurer la première position; sélectionnez le préréglage « Vue d’ensemble » et inclinez la scène à ±60° pour vérifier à quelle distance des barres de grille les positions peuvent être configurées (Figure 8). Pour ce faire, saisissez la valeur d’angle d’inclinaison souhaitée dans la fenêtre « Set Tilt » (Figure 8A). Inspectez le carré « Vue d’ensemble » ou la « Carte de recherche » acquise, déplacez-vous vers une région d’intérêt et appuyez sur Acquérir la recherche. Inspectez l’image « Rechercher ». Si la région d’intérêt n’est pas centrée, cliquez avec le bouton droit à la position souhaitée, puis répétez Déplacer l’étape ici et Acquérir l’image. Réglez Inclinaison (°) sur 0,00 (ou tout autre angle de départ que la scène peut gérer) pour définir l’angle de départ du tomogramme.Pour le premier tomogramme, entrez le Nom de la convention de dénomination du tomogramme souhaité et la valeur de défocalisation souhaitée pour définir la valeur de défocalisation souhaitée pour chaque tomogramme. En option, à partir de Tomo version 5.8, les valeurs de défocalisation peuvent être systématiquement modifiées en une seule fois ; pour cela, cliquez sur Sélectionner les positions, sélectionnez les positions à modifier ou cochez la case pour sélectionner toutes les positions, puis cliquez sur Mettre à jour la mise au point et ajustez les paramètres (Figure 7A). Ajustez les zones « Focus » et « Tracking » (Figure 2C). Cliquez avec le bouton gauche de la souris pour faire glisser les zones de suivi et de mise au point (cercles jaunes et bleus). S’assurer que le suivi/domaine d’intérêt est (principalement) sur le carbone ou une autre caractéristique de suivi appropriée, c.-à-d. une caractéristique similaire à la région d’intérêt; Évitez les fissures, la contamination par la glace, les régions trop épaisses et les trous vides.Lorsque vous choisissez du carbone blanc sans beaucoup de fonctions de suivi, assurez-vous que la zone commence à brûler à mi-chemin du tomogramme en choisissant une dose suffisamment élevée pour la mise au point et en suivant pour brûler lentement l’échantillon à des inclinaisons plus élevées. Cela peut être bénéfique pour maintenir la précision du suivi. Assurez-vous que la zone de suivi/de mise au point n’expose pas une zone d’acquisition ultérieure.REMARQUE: Faites attention à ce qui est proche et à ce qui entrera dans le faisceau. Évitez les zones dont les caractéristiques interviendront avec le suivi et/ou l’exposition, y compris les barres de grille. Appuyez sur Ajouter une position une fois que tous les paramètres sont définis et que la région d’intérêt souhaitée et « Focus » et « Tracking » sont définis. Répétez l’opération pour de nouvelles cibles.REMARQUE: Pour vérifier que la hauteur eucentrique est correctement calibrée pour les positions de lot qui ont été configurées, il existe plusieurs stratégies disponibles. Il est recommandé d’en choisir une en fonction du type de séance de tomographie réalisée (moléculaire, cellulaire, lamelle). Pour la tomographie moléculaire, en supposant que les grilles sont assez plates et que la hauteur eucentrique a été effectuée au centre de chaque carré contenant les positions cibles, ignorez la procédure « Affiner tout » (ou Affiner la sélection si les positions ont été sélectionnées, Figure 7A). Si Tomo a du mal avec la routine d’inclinaison auto-eucentrique par scène, cliquez éventuellement sur Skip Eucentric.Pour les échantillons cellulaires ou lamelles, chaque position du lot peut être à une hauteur z différente. Utilisez « Tout affiner » pour être prudent ou ne cochez pas l’option « Ignorer l’eucentrique ».REMARQUE: « Tout affiner » itérera à travers tous les tomogrammes qui ont été configurés ou sélectionnés via « Sélectionner des positions »; Affinez la hauteur eucentrique et effectuez le suivi et la mise au point avant l’acquisition des données. Cette procédure peut exposer tout chevauchement d’exposition à partir de la prochaine région de mise au point ou de suivi du tomogramme (figure 7B), ce qui devrait être pris en compte avant de continuer. Vérifiez et revisitez les carrés qui n’ont pas été affinés. Avec le bouton droit de la souris, cliquez sur la position défaillante pour voir les options. Si la hauteur eucentrique échoue, trouvez « Auto-eucentrique par inclinaison de scène » (étape 1.4.1.), obtenez une nouvelle image « Rechercher » pour mettre à jour la hauteur z et « Ajouter une position ». Supprimez la position ayant échoué/précédemment initialisée. Cliquez sur l’option Ignorer Eucentrique , ce qui a été fait avec « Tout affiner ».REMARQUE: Si « Affiner tout » n’est pas exécuté, alors « Ignorer Eucentrique » ne doit pas être coché. Tomo5 exécutera un raffinement eucentrique avant l’acquisition de chaque tomogramme; De cette façon, les positions qui échouent au raffinement eucentrique seront ignorées. Exécutez les fonctions automatiques en suivant les étapes ci-dessous.Vérifiez les paramètres pour effectuer les alignements via l’onglet « Fonctions automatiques » en naviguant dans l’atlas vers une zone de carbone. Amenez cette zone à la hauteur eucentrique et suivez l’ordre des alignements comme indiqué ci-dessous.Exécutez Auto-eucentric par inclinaison de scène avec le préréglage « Eucentric Height ». Exécutez la routine Autofocus avec le préréglage « Focus ». Exécutez la routine Autostigmate avec le préréglage « Thon Ring ». Exécutez la routine Autocoma avec le préréglage « Thon Ring ». Insérez l’ouverture de l’objectif souhaitée (figure 6B), probablement l’ouverture de 100 μm, comme un bon compromis pour un contraste d’échantillon accru et seulement une petite coupure du signal à très haute résolution. Répétez la routine Autostigmate après l’insertion de l’ouverture.REMARQUE: À des grossissements avec des tailles de pixels autour de 3 Å et des résolutions inférieures, la routine Autocoma peut échouer; dans ce cas, vérifiez et alignez Tomo Rotation Center sous les alignements directs dans l’interface utilisateur TEM. Vérifiez que la routine de centrage Auto Zero-Loss fonctionne sur votre échantillon. Avec le préréglage « Zéro perte » à une dose raisonnablement élevée (étape 1.2.3), la routine dans les fonctions automatiques aura plus de chances de réussir. Effectuer la collecte de données.Pour démarrer l’acquisition automatisée dans l’onglet « Tomographie », sélectionnez la dalle d’acquisition de données et définissez les paramètres souhaités (Figure 7C). Configurez les paramètres d’acquisition de données : Tilt Step (°), Max. Positive Angle (°), Max. Negative Angle (°), schéma de suivi (recommandé : sélectionnez Track/Focus Before Acquisition). Sélectionnez Fermer les vannes à colonne pour le schéma de hauteur eucentrique.REMARQUE: Les paramètres rarement utilisés sont « Ajuster le temps d’exposition », « Ajuster ZLP », « Utiliser la plaque de phase » et « Pause après inclinaison ».Utilisez l’option Ajuster le temps d’exposition pour les tomogrammes qui ne sont pas destinés à STA afin d’augmenter le temps d’exposition à un rapport spécifié à des inclinaisons plus élevées. L’option Ajuster ZLP exécutera un raffinement ZLP après chaque tomogramme, quelle que soit la périodicité définie. Il est lent, échoue parfois sans raisons évidentes et sautera cette acquisition de position. Cependant, il peut être utile pour une largeur de fente très étroite, c’est-à-dire 3-5 eV sur un filtre Selectris(X). Utilisez la plaque de phase est rarement utilisée depuis l’introduction des DED avec filtres à énergie. Pause After Tilt suspend l’acquisition mais n’autorise aucune modification du logiciel. Vérifiez les paramètres de collecte des données (dans l’onglet « Préparation »), acceptez le calcul de la dose et le schéma d’inclinaison souhaité, spécifiez le nombre de fractions (Nr.) dans le préréglage « Exposition », puis commencez l’acquisition.REMARQUE: Le nombre de fractions dépend de l’échantillon, des paramètres d’acquisition et des étapes de post-traitement prévues, c’est-à-dire STA vs analyse morphologique, et doit être maintenu à des valeurs où la correction de mouvement et l’estimation CTF obtiennent suffisamment de signal. Une plage de 4 à 10 fractions est une bonne estimation, où 4 convient mieux aux échantillons plus épais et 10 aux échantillons moléculaires plus minces.Ensuite, cliquez sur Démarrer pour commencer la collecte de données et surveiller l’acquisition du premier tomogramme pour vous assurer que les tomogrammes sont acquis comme prévu.REMARQUE: Les versions récentes du logiciel de tomographie ont une dalle supplémentaire du lecteur vidéo dans l’onglet « Tomographie » où les tomogrammes acquis peuvent être regardés. Soyez patient pendant le processus de chargement. 2. Cryo-ET STA de l’apoferritine à l’aide d’emClarity REMARQUE: Ici, le logiciel emClarity17 est utilisé pour illustrer la détermination de la structure cryo-ET par STA. La figure 9 résume ce processus. Six séries d’apoferritine (EMPIAR-10787) ont été prises comme exemple. La symétrie octaédrique a été appliquée, et la carte finale avait une résolution de 2,86 Å, obtenue à partir de seulement 4 800 particules et proche de la fréquence de Nyquist (2,68 Å). Assurez-vous que le progiciel emClarity39 est téléchargé et installé (voir le tableau des matières). Installez IMOD pour le traitement du logiciel40.REMARQUE: Une connaissance de base des commandes Linux est requise. Un tutoriel plus détaillé peut être trouvé dans la référence41, qui prend un ensemble de données sur les ribosomes (EMPIAR-10304) comme exemple et décrit les procédures étape par étape. Pour différents types d’échantillons de protéines, un rapport publié précédemment est également disponible42. Préparez les fichiers et répertoires d’entrée.REMARQUE: Les images brutes ont été corrigées par MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (voir le tableau des matériaux). Les images corrigées de mouvement ont été empilées pour générer la série d’inclinaison à l’aide de newstack (IMOD) et alignées manuellement avec le suivi des correctifs à l’aide d’Etomo (voir le tableau des matériaux), suivi d’emClarity. Pour obtenir de meilleurs alignements, il est recommandé d’effectuer des décalages et une compensation d’inclinaison dans Etomo. Les six séries d’inclinaison sont renommées TS1 à TS6. Vous trouverez ci-dessous les instructions et les commandes pour la première série d’inclinaison (TS1) à titre d’exemple.Créez un dossier de projet.REMARQUE: La dernière version du logiciel est 1.5.3.11. Tous les journaux logiciels associés se trouvent dans le dossier du projet local (…/logFile/emClarity.logfile). Sous le dossier du projet, créez un autre dossier, « fixedStacks », et préparez les fichiers d’entrée : TS1.fixed, TS1.xf et TS1.tlt.REMARQUE: TS1.fixed: la série d’inclinaison originale, également connue sous le nom de TS1.st dans Etomo. TS1.xf : ce fichier contient les coordonnées de transformation après Etomo tiltalign. TS1.tlt : ce fichier contient des angles d’inclinaison. Estimez la défocalisation en suivant les étapes ci-dessous.Calculez la défocalisation. Mettez à jour le fichier de paramètres avec les paramètres du microscope et de l’imagerie en suivant le tableau supplémentaire 1. Copiez un fichier de paramètres dans le dossier du projet, remplacez son nom par param_ctf.m et exécutez : emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.Remarque : le modèle de fichier de paramètres se trouve dans le fichier supplémentaire 1 ou le répertoire d’installation du logiciel local (…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/). Vérifiez les résultats de l’estimation CTF pour chaque pile.Vérifiez les piles alignées (par exemple, aliStacks/TS1_ali1.fixed) en utilisant 3dmod et assurez-vous que les perles fiduciaires sont effacées correctement. Assurez-vous que le fichier journal signale que la manipulation est correcte, ce qui se trouve dans logfile/emClarity.logfile (Figure 9). Vérifiez la valeur de défocalisation (par exemple, fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) et assurez-vous qu’elle correspond à l’estimation théorique du CTF. Définir les sous-régions.Générez un tomogramme classé. Dans le dossier du projet, exécutez : sh recScript2.sh -1.REMARQUE: Un tomogramme plus petit (en taille) pour chaque pile sera stocké dans un nouveau dossier « bin10 ». Pour accélérer le processus, les coordonnées d’une ou plusieurs sous-régions peuvent être définies dans un tomogramme bin10. Le fichier de script se trouve dans le répertoire local d’installation du logiciel (…/emClarity_1.5.3.11/docs/). Déterminez les limites en choisissant six points, x min, x max, y min, ymax, z min et zmax, pour créer une sous-région. Sous le dossier « bin10 », exécutez : 3dmod TS1_bin10.rec.REMARQUE : Si quatre sous-régions doivent être créées dans une série d’inclinaison, choisissez 6 × 4 = 24 points. Chaque pile doit avoir un fichier de modèle (*.mod) sous le dossier « bin10 ». Convertissez les fichiers de modèle au format emClarity. Cela créera une nouvelle reconnaissance de dossier. Stockez toutes les coordonnées de chaque sous-région dans ce dossier. Dans le dossier du projet, exécutez : sh recScript2.sh TS1. Choisissez des particules.Trouvez un modèle d’apoferritine pour prélever des particules. Téléchargez un modèle à partir de la Banque de données sur la microscopie électronique (EMD-10101)44. Assurez-vous que la taille en pixels du modèle correspond à celle des données brutes. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity redimensionner ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu. Générer des tomogrammes corrigés CTF pour la cueillette des particules. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch. Effectuer la sélection des particules pour chaque sous-région. Pour le jeu de données sur l’apoferritine, effectuez une recherche de modèle sur bin6. Modifiez les paramètres Tmp_angleSearch (θ out, Δout, θ in, Δin) pour déterminer la plage d’angles et les intervalles pour la recherche dans le plan ou hors plan en degrés. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.Remarque : Un dossier « convmap_wedge_Type2_bin6 » sera généré dans cette étape. Le fichier csv sous ce dossier (par exemple, TS1_1_bin6.csv) contient toutes les informations sur les particules prélevées. Supprimez les particules incorrectes à l’aide de 3dmod. Sous le dossier « convmap_wedge_Type2_bin6 », exécutez : 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.REMARQUE: Il est courant de trouver de mauvaises particules à côté des bords de carbone ou des contaminations de glace dans ces zones. Effectuez un clic droit de la souris sur les points incorrects et appuyez sur le retour arrière du clavier pour les supprimer. Dans cette étape, assurez-vous que la plupart des faux positifs sont supprimés (Figure 10). Changez le nom du dossier « convmap_wedge_Type2_bin6 » en « convmap », car emClarity ira chercher des informations de sous-région sous convmap dans les étapes suivantes. Initialisez le projet. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity init param0.m, pour créer une base de données pour emClarity, ApoF.mat. Effectuer la reconstruction des tomogrammes avant STA et l’alignement. Pour générer des tomogrammes de sous-région corrigés par CTF à bin4, exécutez : emClarity ctf 3d param0.m.REMARQUE : Les tomogrammes corrigés par CTF (par exemple, cache/TS1_1_bin4.rec)  seront générés dans un nouveau dossier « cache ». Effectuer STA et alignement.Effectuer la moyenne à l’aide des sous-tomogrammes corrigés par la FCE à partir de la catégorie 4. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity avg param0.m 0 RawAlignment. Continuez à effectuer des alignements et exécutez : emClarity alignRaw param0.m 0.Remarque : L’étape de calcul de la moyenne génère une référence, qui sera utilisée par emClarity dans cette étape pour aligner les particules. Les paramètres Raw_angleSearch (θ out, Δout, θ in, Δin) peuvent être modifiés pour définir la plage d’angles et la taille des pas pour chaque cycle. Comme la plupart des particules incorrectes sont supprimées de la base de données (étape 2.6.4), ces paramètres angulaires pour l’alignement peuvent commencer avec un degré relativement faible. Mettez à jour les paramètres Raw_angleSearch et exécutez quelques cycles supplémentaires (étapes 2.9.1 et 2.9.2). Pour accélérer le processus, effectuez séparément les alignements dans le plan et hors plan.REMARQUE: Pour chaque classage, il est recommandé d’exécuter plusieurs cycles et de réduire progressivement les paramètres angulaires. Pour l’ensemble de données ApoF, cinq autres cycles à la catégorie 4 ont été effectués, et de plus amples détails sont disponibles dans le tableau supplémentaire 2. Pour cycle001, dans le dossier du projet, exécutez : emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, suivi de emClarity alignRaw param1.m 1. Nettoyez les particules superposées. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity removeDuplicates param5.m 5. Effectuez un raffinement de la série Tilt avec tomoCPR.Remarque : Cette étape est facultative.Exécutez tomoCPR pour affiner la géométrie de la pile. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity tomoCPR param5.m 5. Générez des piles nouvellement alignées et mettez à jour les fichiers de géométrie. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity ctf update param6.m.Remarque : Assurez-vous que les nouveaux fichiers de géométrie (par exemple, fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) et les piles nouvellement alignées (par exemple, aliStacks/TS1_ali2.fixed) sont correctement générés. Créez de nouveaux sous-tomogrammes à bin2. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity ctf 3d param6.m.REMARQUE : Cela sera suivi de quelques cycles pour la moyenne et l’alignement à la case 2 (étapes 2.9.1, 2.9.2 et 2.9.3), le nettoyage en double (étape 2.9.4) et la RCP facultative (étape 2.10). En raison de la symétrie élevée, cinq autres cycles à bin2 ont été effectués pour l’apoferritine. Mettez à jour les paramètres Raw_angleSearch pour chaque cycle. Effectuer la reconstruction finale.Continuez à exécuter quelques cycles à bin1 et tomoCPR (étape 2.9 et étape 2.10). 10 autres cycles à bin1 ont été effectués pour l’ensemble de données sur l’apoferritine. Vous trouverez plus de détails concernant les commandes et les paramètres dans le tableau 2. Effectuez la reconstruction finale en combinant les deux demi-jeux de données. Dans le dossier du projet, exécutez : emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, suivi de emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.REMARQUE: La carte finale (par exemple, avec un facteur B de 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) sera générée, Figure 11.

Representative Results

Pour les échantillons cellulaires et lamelles, la stratégie de collecte de données dépend en grande partie de l’échantillon et de l’objectif de l’étude d’imagerie (figure 1). L’approche de ciblage varie selon que la cible moléculaire est in situ ou préparée à partir du complexe macromoléculaire purifié pour des échantillons de reconstruction à haute résolution contenant des cibles moléculaires. Pour les complexes purifiés vitrifiés sur des grilles de trous (carbone), le ciblage peut simplement être basé sur l’imagerie dans les trous du film de support (carbone). Pour le travail in situ , l’approche de ciblage nécessite une connaissance de l’emplacement de l’entité moléculaire basée sur des données corrélatives ou des repères cellulaires connus à faible grossissement. Les repères cellulaires devraient idéalement être identifiables lors de la prise d’images de vue d’ensemble et, s’ils sont suffisants pour localiser approximativement les régions d’intérêt, peuvent fournir un moyen rapide de confirmer l’identité de la cible avec une image de recherche. Cependant, si les événements observables sont rares, des images de recherche à grossissement moyen peuvent être nécessaires pour qualifier la cible est correcte. Les cartes de recherche sont des montages à grossissement moyen d’images de recherche et peuvent, ainsi, rendre la recherche de cibles beaucoup plus facile, où elles peuvent être acquises à un grossissement auquel la caractéristique d’intérêt est visible. Les cartes de recherche peuvent ensuite être filtrées pour trouver et configurer les positions des lots cibles. Pour les spécimens contenant des caractéristiques cellulaires pour la reconstruction ultrastructurale, l’approche de ciblage est similaire, bien que dépendant également de la visibilité de l’événement cellulaire à divers grossissements et de sa prévalence dans l’échantillon. La stratégie d’acquisition de données doit également être prise en compte; Dans tous les cas, l’objectif de l’étude détermine en grande partie la façon dont les données sont recueillies. Pour la reconstruction de l’ultrastructure cellulaire, un faible grossissement (20-5 Å / px) et un grand champ de vision peuvent être appropriés, mais des grossissements élevés sont nécessaires pour reconstruire les détails moléculaires ou à haute résolution (5-1 Å / px). Un ensemble de données collecté à 1,5 Å/px dans des conditions idéales ne pourra physiquement produire une reconstruction qu’à la fréquence de Nyquist de 3,0 Å/px; Cependant, en réalité, de nombreux facteurs, y compris, mais sans s’y limiter, l’épaisseur, la taille et l’hétérogénéité de l’échantillon, affectent tous la qualité de reconstruction obtenue. Les paramètres d’imagerie exacts équilibrent également le grossissement en fonction de l’objectif de l’étude avec le champ de vision pour contenir suffisamment d’informations. Cet article présente un cas moyen de sous-tomogramme atteignant 2,86 Å, mais des études supplémentaires 17,42,43,44,45 sont présentées dans le tableau 1 pour illustrer les paramètres de collecte associés aux études ciblant différents critères de jugement17,42,45,46. Une fois qu’un flux de travail de ciblage et un régime d’acquisition de données pour cryo-ET sont établis, la collecte de données de nombreux types d’échantillons différents est possible. Des tomogrammes représentatifs d’une variété de spécimens sont présentés ici : échantillons moléculaires tels que l’apoferritine (film 1), les processus cellulaires minces (film 2) et les lamelles broyées FIB du spécimen cellulaire épais (film 3). Figure 1 : Présentation de la configuration du flux de travail de tomographie. Le flux de travail d’imagerie cryo-ET décrit dans le protocole est représenté sous forme d’organigramme. Les images qui devraient être acquises sont montrées pour le flux de travail cellulaire et moléculaire. La dénomination présentée suit la convention Tomo5, bien que la plupart des logiciels d’acquisition de tomographie partagent des principes communs pour la collecte de ces images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : onglet Préparation et conditions prédéfinies de recherche. (A) Image générale de l’onglet entier. Les paramètres prédéfinis de condition d’imagerie sont définis dans cet onglet, et les options « Calibrer le décalage de l’image » et « Paramètres du filtre d’image » se trouvent dans la liste déroulante « Tâches ». (B) Zoom avant de la liste déroulante « Préréglages » où chaque préréglage peut être sélectionné pour la configuration des conditions d’imagerie individuelles. (C) Image représentant un grossissement adéquat pour adapter à la fois l’exposition et la zone « Mise au point et suivi » dans le champ de vision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Calculs de dose. Exemples de calculs de dose pour d’éventuels schémas d’acquisition de tomogrammes où le débit de dose a été mesuré sous vide. Les deux calculs déterminent le(s) temps(s) d’exposition pour chaque inclinaison, qu’il s’agisse de viser une dose optimale par inclinaison ou une dose totale optimale pour la série d’inclinaison complète. Dans la moyenne des sous-tomogrammes, il est courant de cibler une dose optimale par image inclinée dans la plage de 3,0 à 3,5 e-/Å2. Dans les deux cas, les « Fractions (Nr.) » sont réglées sur 6 pour atteindre ~0,5 e-/Å2 de dose par image de film de l’inclinaison pour un signal suffisant pour effectuer une correction de mouvement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : onglet Atlas. Image de présentation de l’onglet « Atlas ». L’image a été recadrée pour éviter les espaces de position de la grille vides. Le menu « Tâches » contient les préférences de configuration de session et les espaces de sélection de grille pour la sélection individuelle de toutes les grilles inventoriées et une option pour acquérir un seul atlas après le retrait de la cassette du chargeur automatique. Une grille sélectionnée peut être réinitialisée, puis réacquise. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Décalages d’image calibrés. L’image représente une image d’exposition et de recherche. La croix rouge dans l’image de recherche est le marqueur décalé pour corriger le décalage entre l’exposition et la recherche. Il faut refaire les étalonnages de décalage d’image au début de la session ou après avoir modifié les préréglages des conditions d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Fonctions et ouvertures automatiques. (A) L’onglet « Fonctions automatiques » représente la liste déroulante « Préréglages » et la sélection « Tâche ». Souligné en bleu est le préréglage « Thon Ring » requis pour « Autostigmate » (également souligné en bleu) et « Autocoma ». Il faut sélectionner les préréglages respectifs pour chaque tâche, puis appuyer sur le bouton Démarrer. (B) Les ouvertures se trouvent dans l’interface utilisateur TEM. Sélectionnez « Ouverture de l’objectif » souhaité après l’exécution des fonctions automatiques et exécutez « Autostigmate » avec l’ouverture enfoncée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Vue d’ensemble de l’onglet Tomographie. Les images montrent l’interface utilisateur de Tomo 5.8. (A) Positions des lots. Les dernières fonctions représentées dans l’image: l’option « Acquérir la carte de recherche »; Les positions des tomogrammes sont affichées dans la vue Atlas avec l’option de zoom avant; surligné en haut à droite est « Sélectionner des positions »; ci-dessous, les quatre positions ont été sélectionnées pour mettre à jour les paramètres de défocalisation. (B) Trois positions sont sélectionnées sur la carte de recherche, étiquetées 1, 2 et 3. La position 1 ne posera pas de problème lors de l’exécution de « Tout affiner ». Cependant, si dans un contexte de densité cible élevée, par exemple lorsque les positions des lamelles sont sélectionnées, comme illustré pour la position 2 et la position 3, alors « Affiner tout » exécutera la routine « Suivi » et « Mise au point » sur la région « Exposition » de la position 2, exposant la cible avant que le tomogramme ne soit acquis. Le type de grille est R1.2/1.3. Barre d’échelle = 1,2 μm. (C) Acquisition de données. Les positions sélectionnées configurées dans « Batch Positions » peuvent désormais être acquises individuellement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Définition de l’angle d’inclinaison maximal. La figure illustre une approche étape par étape pour déterminer la plage d’inclinaison maximale pour les acquisitions de tomogrammes. (A) Vue d’ensemble de 0° et carte de recherche au centre du carré de la grille. Pour tester la plage d’inclinaison, l’angle peut être réglé dans le logiciel de tomographie avec « Set Tilt (°) » en tapant la valeur souhaitée, puis en appuyant sur Set. (B) La scène a été inclinée à −60°, ce qui montre qu’un coin de la carte de recherche ne serait pas entièrement acquis à −60°. (C) La scène a été inclinée à 60°. En comptant les trous qui ont disparu à ±60°, on peut avoir une idée de la plage d’inclinaison d’un carré de grille. Barres d’échelle = 2,5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 9 : organigramme emClarity. L’organigramme décrivait les différentes étapes de la moyenne des sous-tomogrammes cryogéniques. Barres d’échelle = 50 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 10 : Correspondance des modèles à l’aide d’emClarity. (A) Micrographie typique de l’apoferritine sur une grille recouverte de graphène. Défocalisation : −3,430 μm. (B) Une tranche du tomogramme recouverte de points de modèle après la recherche du modèle. (C) Une vue de haut et (D) une projection latérale des points du modèle, indiquant une seule couche plate de particules d’apoferritine monodispersées. Barres d’échelle = 50 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 11 : Cryo-ET STA de l’apoferritine. (A) La carte finale après 21 cycles d’alignement du sous-tomogramme. (B) Le diagramme de corrélation de Fourier (FSC) de la carte finale avec une résolution rapportée de 2,86 Å, contenant 38 FSC de cônes. (C) Cartes de densité représentatives (équipées du modèle PDB 6s6147). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Échantillon Type Cryo-ET Å/px Plage d’inclinaison (+/-) Pas d’inclinaison (°) Plage de flou (μm) Dose totale (e-/Å2) Résolution Données brutes Référence Apoferritine Purifié/moléculaire (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 EMPIAR-10787 17 & cet article Gag VIH-1 Purifié/moléculaire (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17 Ribosome Purifié/moléculaire (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 EMPIAR-10304 42 Pic de SARS-CoV-2 Lamella/Moléculaire (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 EMPIAR-10753 45 Structure de l’axone neuronal Cellulaire (ultrastructurel) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 N.D. EMPIAR-10922 47 Tableau 1 : Paramètres de collecte pour plusieurs études cryo-ET. Études ciblant la reconstruction de détails moléculaires à partir de protéines purifiées ou in situ par rapport à une étude visant à résoudre et à segmenter les caractéristiques cellulaires ultrastructurales. Film 1: Un tomogramme d’échantillons d’apoferritine sur une grille EM normale, puis imagé avec un cryo-TEM équipé d’une caméra ultra-haute résolution avec un filtre compatible. Les séries d’inclinaison ont été acquises avec un schéma dose-symétrique, avec une durée d’inclinaison de 54° et une dose totale de 134 e-/A2 dans le logiciel de tomographie électronique. Barre d’échelle = 50 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film. Film 2: Un tomogramme d’un neurone primaire cultivé sur une grille EM puis directement imagé avec un cryo-TEM équipé d’une caméra ultra-haute résolution avec un filtre compatible. Les séries d’inclinaison ont été acquises avec un schéma dose-symétrique, avec une durée d’inclinaison de 60° et une dose totale de 120 e-/A2 dans le logiciel de tomographie électronique. Barre d’échelle = 100 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film. Film 3: Un tomogramme d’une cyanobactérie sur une grille EM, soumis à un fraisage FIB puis imagé avec un cryo-TEM équipé d’une caméra haute vitesse et d’un filtre compatible. Les séries d’inclinaison ont été acquises avec un schéma dose-symétrique, avec une inclinaison de 50° et une dose totale de 120 e-/A2 dans le logiciel de tomographie électronique. Barre d’échelle = 87,2 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film. Fichier supplémentaire 1 : modèle de fichier de paramètres pour estimer la défocalisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Tableau supplémentaire 1 : Collecte des données et détails de configuration du microscope. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Tableau supplémentaire 2 : Liste des commandes dans l’ordre d’exécution. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Tomo5
La description du flux de travail du logiciel de tomographie met en évidence une méthode potentielle et la plus rationalisée pour une configuration de session de tomographie par lots (à distance). Bien que le logiciel soit facile pour les débutants, une expérience initiale de cryo-EM et une compréhension de base de la tomographie peuvent aider à la configuration. Les étapes critiques sont mises en évidence dans le protocole et devraient aider à résoudre le problème même si une approche de configuration différente a été utilisée. L’avancement du logiciel facilitera la collecte de données (à distance) et rendra cryo-ET plus accessible à une large base d’utilisateurs. Quelques conseils et astuces qui peuvent vous aider à résoudre les problèmes fréquemment rencontrés sont décrits ci-dessous.

Un point important à discuter est le choix des grilles car, lors de l’inclinaison de l’échantillon à ±60°, les barres de grille à forte inclinaison peuvent obscurcir la vue (Figure 8). Sur une grille TEM, le maillage fait référence au nombre de carrés de grille par unité de longueur de la grille. Les grands nombres de maillage ont plus de carrés de grille par unité de longueur, une densité plus élevée de carrés de grille et des carrés de grille plus petits, c’est-à-dire qu’une grille de 400 mailles a des carrés plus petits qu’une grille de 200 mailles. Un bon choix de grilles pour la tomographie est les grilles à 200 mailles ou 300 mailles. Comme le montre la figure 8, la surface disponible pour la collecte est réduite lorsque la grille est inclinée. À ±60° d’inclinaison, une grille de 300 mailles aura un petit champ de vision sur lequel un tomogramme complet peut être acquis. Les avantages des grilles à 200 mailles sont que les carrés de grille plus grands rendent la tomographie moléculaire plus rapide, et avec l’augmentation de la surface des carrés de grille, un carré sera probablement suffisant pour une collecte de nuit. L’inconvénient est que les grilles à 200 mailles sont plus fragiles, donc la manipulation et l’écrêtage demandent plus de finesse.

De plus, si vous utilisez un film de support troué (voir Tableau des matériaux) sur des grilles EM, l’espacement des trous doit être pris en compte pour la configuration de la zone de mise au point et de suivi par rapport à la région d’exposition. Idéalement, le diamètre du faisceau au grossissement souhaité devrait être suffisamment petit pour couvrir la zone de carbone adjacente à la zone d’exposition le long de l’axe d’inclinaison pour une configuration optimale et rapide. De cette façon, les régions d’intérêt potentielles dans chaque trou peuvent être acquises.

Comme la routine de hauteur eucentrique du logiciel n’est actuellement pas aussi robuste, comme la routine serialEM, les conseils suivants peuvent contourner ce problème. Si la détermination de la hauteur eucentrique échoue en utilisant le préréglage de hauteur eucentrique, on peut utiliser le préréglage de vue d’ensemble à la place et réexécuter « Auto-eucentrique par inclinaison de scène »; Cela peut résoudre les problèmes si la hauteur eucentrique est loin de 0. Si cela réussit, on peut relancer « Auto-eucentrique par inclinaison de la scène » avec des préréglages « Hauteur eucentrique » pour améliorer la précision. En cas d’échec, on peut exécuter « Auto-Eucentric by beam tilt » avec le préréglage eucentrique de hauteur, puis relancer « Auto-Eucentric by stage tilt » ou régler manuellement la hauteur z consolidée par « Auto-Eucentric by beam tilt » dans l’interface utilisateur TEM sous les paramètres « Stage ». Dans le cas où des grilles avec un motif répétitif de trous sont utilisées, elles peuvent empêcher l’identification d’un seul pic de corrélation croisée. On peut essayer de modifier la hauteur eucentrique prédéfinie à un décalage de flou inférieur tel que -25 μm et / ou un temps d’exposition plus court pour réduire la corrélation croisée des motifs de trou. D’autre part, l’utilisation de grilles de dentelle / lamelles peut ne pas fournir un signal suffisant pour un pic de forte corrélation croisée. On peut essayer de modifier la hauteur eucentrique prédéfinie pour un décalage de défocalisation plus grand tel que -75 μm et / ou un temps d’exposition prolongé pour améliorer le pic de corrélation croisée. Une autre option consiste à ajuster les paramètres de filtre d’image; ils se trouvent dans l’onglet « Préparation ». Les options permettant d’ajuster les paramètres de filtre peuvent être définies pour un grossissement faible (Vue d’ensemble/Gridsquare), moyen (Hauteur eucentrique) et élevé (Suivi/Mise au point) afin de trouver le pic de corrélation croisée optimal pour chaque préréglage. L’entrée requise est une image, c’est-à-dire à 0° et une à 5°, suivie d’un clic sur Comparer pour comparer les deux images. La valeur de départ recommandée pour la longueur d’onde la plus longue est un quart de la barre d’échelle dans l’image et pour la longueur d’onde la plus courte est un quarantième de la barre d’échelle. Si le pic n’est pas identifié de manière robuste, on peut optimiser les paramètres jusqu’à ce qu’un pic convaincant puisse être trouvé. Il n’est pas nécessaire de réacquérir des images à chaque fois; il suffit d’appuyer sur « Comparer ». Si TOMO ne parvient toujours pas à trouver automatiquement la hauteur eucentrique, l’étalonnage manuel de la hauteur eucentrique peut être utilisé. Il faut centrer sur un cristal de glace raisonnablement grand dans le grossissement général dans l’onglet « Préparation », puis aller au « Contrôle de scène » de l’interface utilisateur TEM, régler alpha à -30° et ajuster la valeur z de l’étape pour recentrer le cristal à l’aide de l’image fluorescente de l’écran. La sélection des paramètres « Haute résolution » et « Contraste élevé » dans l’interface utilisateur de la GDT simplifiera cette tâche (boutons au bas de la fenêtre de l’écran fluorescent). En option, s’il y a accès à une caméra avec le mode live, cela peut être utilisé pour déterminer la hauteur eucentrique; Ce sera plus facile que sur l’écran fluorescent.

Les plus grandes limitations dans les versions Tomo5 antérieures à 5.8 sont les montages de grossissement moyen manquants, le schéma symétrique de dose manquant et les problèmes liés à la recherche de hauteur eucentrique. Ceux-ci existent dans serialEM, un logiciel gratuit avec un développement rapide et un soutien communautaire, une routine de hauteur eucentrique robuste et la possibilité de scripter, c’est-à-dire un schéma symétrique de dose personnalisé. À partir de la version 5.8 dans Tomo5, le problème le plus fréquemment rencontré pour trouver la hauteur eucentrique, c’est-à-dire une boucle infructueuse autour de la valeur z cible, a été résolu en implémentant l’option de définir un critère d’acceptation de hauteur eucentrique. Cependant, avec différents types de grille et d’échantillons, il est fortement recommandé d’ajuster les paramètres du filtre d’image pour refléter les conditions d’imagerie uniques des séances individuelles et de donner le meilleur pic de corrélation croisée possible pour trouver la hauteur eucentrique et pour que la zone de mise au point et de suivi fonctionne de manière fiable lors de l’acquisition du tomogramme.

Dans l’ensemble, de nombreuses installations se sont rapidement adaptées aux opérations à distance pendant la pandémie. Le logiciel Tomo5 offre un accès facile et un itinéraire convivial vers la tomographie qui est bien adapté à l’utilisation à distance. Les progrès réalisés dans le logiciel continueront sans aucun doute à rendre les collectes de données à distance et la collecte de tomographie en général plus courantes dans la communauté.

emClarity
Comme emClarity utilise une méthode de sélection de particules basée sur un modèle, il a besoin d’un modèle pour l’objet qui vous intéresse. La cueillette des particules (étape 2.6) est très sensible et essentielle à la structure finale. Avant de faire la moyenne et l’alignement (étape 2.9), il faut s’assurer de vérifier soigneusement et de supprimer manuellement les faux positifs. Lorsqu’un modèle n’est pas disponible, emClarity peut ne pas être facile à utiliser, mais il est possible d’utiliser d’autres logiciels, par exemple, Dynamo37 et PEET48, pour créer un modèle initial.

Pour les échantillons hétérogènes, emClarity est équipé d’une méthode de classification qui permet aux utilisateurs de se concentrer sur des caractéristiques spécifiques avec différentes échelles. Il est utile d’exécuter quelques cycles d’alignements avant la classification et de l’exécuter à un regroupement plus élevé (tel que le bac 4 ou le bac 3).

La version à jour du logiciel (V1.5.3.11) a des mises à jour significatives par rapport à la première version (V1.0)17. Ceux-ci comprennent, sans toutefois s’y limiter, un contrôle de la maniabilité lors de l’estimation de la FCE (étape 2.3); symétrie pour les alignements (CX, I, I2, O); calcul des fonctions d’échantillonnage 3D par particule (3DSF); un passage à MATLAB 2019a pour la compatibilité et la stabilité ; et la reconstruction à l’aide des images de projection brutes (cisTEM). Le logiciel continuera de s’améliorer pour divers échantillons, et les annonces les plus récentes peuvent être consultées en ligne (voir le tableau des matériaux).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Diamond Light Source pour l’accès et le soutien des installations cryo-EM du Centre national de bio-imagerie électronique (eBIC) du Royaume-Uni, financé par le Wellcome Trust, MRC et BBRSC. Nous tenons également à remercier Andrew Howe pour l’acquisition du tomogramme Apoferritin (film 1), Ishika Kumar pour la préparation et l’acquisition du tomogramme neuronal (film 2) et Craig MacGregor-Chatwin pour le tomogramme lamellaire cyanobactérien (film 3).

Materials

Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG – Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil – A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan –
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific –
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ – – Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ – – Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial – – Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software – – Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki – – Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity
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Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).
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