Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi
Summary
Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.
Abstract
Heterorhabditis ve Steinernema cinslerindeki entomopatojenik nematodlar, toprakta yaşayan böceklerin zorunlu parazitleridir. Yaşam döngülerinin temel özelliği, sırasıyla Photorhabdus ve Xenorhabdus bakterileri ile karşılıklı ilişkidir. Nematod parazitleri, uygun böcek konakçılarını bulabilir ve girebilir, böcek bağışıklık tepkisini bozabilir ve enfekte etmek için yeni böcek avını aktif olarak avlayacak yeni nesli üretmek için verimli bir şekilde çoğalabilir. Yaşam döngülerinin özellikleri nedeniyle, entomopatojenik nematodlar, yıkıcı tarımsal böcek zararlılarını kontrol etmek için böcek öldürücülerle birlikte kullanılan popüler biyolojik kontrol ajanlarıdır. Aynı zamanda, bu paraziter nematodlar, nematod patojenitesini ve konakçı anti-nematod yanıtlarını analiz etmek için bir araştırma aracını temsil eder. Bu araştırma, enfeksiyon sırasında nematod salgılanan moleküllerin rolünü anlamak için genetik tekniklerin ve transkriptomik yaklaşımların son zamanlarda geliştirilmesi ile desteklenmektedir. Burada, entomopatojenik nematodların korunması ve bir gen nakavt prosedürünün kullanılması konusunda ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bu metodolojiler ayrıca entomopatojenik nematod enfeksiyon faktörlerinin fonksiyonel karakterizasyonunu teşvik etmektedir.
Introduction
Entomopatojenik nematodlar (EPN) üzerine yapılan araştırmalar, öncelikle bu parazitlerin entegre haşere yönetimi stratejilerindeki yararları ve temel biyomedikal araştırmalara katılımları nedeniyle son birkaç yılda yoğunlaşmıştır 1,2. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, EPN’yi, enfeksiyon sürecinin farklı aşamalarında aktive olan nematod genetik bileşenlerini incelemek için model organizmalar olarak belirlemiştir. Bu bilgi, konakçı fizyolojisini değiştirmek ve böceğin doğuştan gelen bağışıklık tepkisini istikrarsızlaştırmak için parazitler tarafından salgılanan moleküllerin doğası ve sayısı hakkında kritik ipuçları sağlar 3,4. Aynı zamanda, bu bilgi yaygın olarak böcek konakçısı immün sinyal yollarının tipi ve patojenlerin girişini ve yayılmasını kısıtlamak için düzenledikleri işlevler hakkında yeni detaylarla desteklenmektedir 5,6. Bu süreçleri anlamak, EPN ve böcek konakçıları arasındaki dinamik etkileşimin her iki tarafını da öngörmek için çok önemlidir. EPN-böcek konakçı ilişkisinin daha iyi değerlendirilmesi, kuşkusuz, insan bağışıklık sistemine müdahale eden enfeksiyon faktörlerinin tanımlanmasına ve karakterize edilmesine yol açabilecek memeli parazitik nematodlarla benzer çalışmaları kolaylaştıracaktır.
EPN nematodları Heterorhabditis sp. ve Steinernema sp. çok çeşitli böcekleri enfekte edebilir ve biyolojileri daha önce yoğun bir şekilde incelenmiştir. İki nematod paraziti, Heterorhabditis kendi kendine döllenirken ve Steinernema’nın amfimiktik üreme geçiren üreme biçimlerinde farklılık gösterir, ancak son zamanlarda S. hermaphroditum’un hermafroditlerin kendi kendine döllenmesi veya partenogenez 7,8,9 yoluyla çoğaldığı gösterilmiştir. Heterorhabditis ve Steinernema nematodları arasındaki bir diğer fark, her ikisi de böceklerin güçlü patojenleri olan sırasıyla iki farklı Gram-negatif bakteri cinsi, Photorhabdus ve Xenorhabdus ile simbiyotik karşılıklılıklarıdır. Bu bakteriler, EPN’nin serbest yaşayan ve beslenmeyen enfektif juvenil (IJ) aşamasında, duyarlı konakçıları tespit eden, hızla çoğalan ilişkili bakterilerini serbest bıraktıkları böcek hemokoluna erişen ve böcek dokularını kolonize eden bulunur. Hem EPN hem de bakterileri, böcek savunmasını silahsızlandıran ve homeostazı bozan virülans faktörleri üretir. Böcek ölümünü takiben, nematod IJ’ler yetişkin EPN olmak ve yaşam döngülerini tamamlamak için gelişir. Yiyecek yoksunluğuna ve böcek kadavrasındaki aşırı kalabalığa yanıt olarak oluşan yeni bir IJ kohortu, uygun konakçıları avlamak için toprakta nihayet ortaya çıkar 9,10,11,12.
Burada, EPN nematodlarının bakımı, çoğaltılması ve genetik olarak manipüle edilmesi için etkili bir protokol açıklanmaktadır. Protokol özellikle, simbiyotik H. bakteriyophora ve S. carpocapsae IJ’lerin replikasyonunu, aksenik nematod IJ’lerin oluşumunu, mikroenjeksiyon için H. bacteriophora hermafroditlerinin üretimini, dsRNA’nın hazırlanmasını ve mikroenjeksiyon tekniğini özetlemektedir. Bu yöntemler, nematod patojenitesinin moleküler temelini ve konakçı anti-nematod bağışıklığını anlamak için gereklidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entomopatojenik nematod enfeksiyonunun ve böcek anti-nematod bağışıklığının moleküler temelini anlamak, parazitlerin karşılıklı olarak ilişkili bakterilerden ayrılmasını gerektirir13,15,16. Entomopatojenik nematodlar H. bacteriophora ve S. carpocapsae sırasıyla Gram-negatif bakteriler P. luminescens ve X. nematophila ile birlikte yaşar17. Her iki ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
George Washington Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü üyelerine yazının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Tüm grafik figürler BioRender kullanılarak yapılmıştır. I. E., J. H. ve D. O’H. araştırmaları. Laboratuvarlar, George Washington Üniversitesi ve Columbian College of Arts and Sciences tarafından desteklenerek fonları ve Disiplinler Arası Araştırma Fonlarını kolaylaştırmıştır.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
