Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Het onderzoek naar entomopathogene nematoden (EPN) is de afgelopen jaren geïntensiveerd, voornamelijk vanwege het nut van deze parasieten in geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën en hun betrokkenheid bij fundamenteel biomedisch onderzoek ^1,2. Recente studies hebben EPN vastgesteld als modelorganismen om de genetische componenten van nematoden te onderzoeken die worden geactiveerd tijdens de verschillende stadia van het infectieproces. Deze informatie geeft kritische aanwijzingen over de aard en het aantal moleculen dat door de parasieten wordt uitgescheiden om de fysiologie van de gastheer te veranderen en de aangeboren immuunrespons van het insect te destabiliseren ^3,4. Tegelijkertijd wordt deze kennis vaak aangevuld met nieuwe details over het type immuunsignaleringsroutes van insectengasten en de functies die ze reguleren om de binnenkomst en verspreiding van de pathogenen te beperken ^5,6. Het begrijpen van deze processen is cruciaal voor het bedenken van beide zijden van het dynamische samenspel tussen EPN en hun insectengastheren. Een betere waardering van de gastheerrelatie tussen EPN en insecten zal ongetwijfeld vergelijkbare studies met parasitaire nematoden van zoogdieren vergemakkelijken, wat kan leiden tot de identificatie en karakterisering van infectiefactoren die interfereren met het menselijk immuunsysteem.

De EPN-nematoden Heterorhabditis sp. en Steinernema sp. kunnen een breed scala aan insecten infecteren en hun biologie is eerder intensief bestudeerd. De twee nematodenparasieten verschillen in hun voortplantingswijze, waarbij heterorhabditis zelfbevrucht is en Steinernema amphimictische reproductie ondergaat, hoewel onlangs S. hermafroditum zich heeft voortgeplant door zelfbevruchting van hermafrodieten of door parthenogenese ^7,8,9. Een ander verschil tussen Heterorhabditis en Steinernema-nematoden is hun symbiotische mutualisme met twee verschillende geslachten van Gram-negatieve bacteriën, respectievelijk Photorhabdus en Xenorhabdus, die beide krachtige pathogenen van insecten zijn. Deze bacteriën worden aangetroffen in het vrijlevende en niet-voedende infectieuze juveniele (IJ) stadium van het EPN, die gevoelige gastheren detecteren, toegang krijgen tot de insectenhemocoel waar ze hun geassocieerde bacteriën vrijgeven die zich snel repliceren en insectenweefsels koloniseren. Zowel het EPN als hun bacteriën produceren virulentiefactoren die de afweer van insecten ontwapenen en de homeostase aantasten. Na de dood van insecten ontwikkelen de nematode-IJs zich tot volwassen EPN en voltooien ze hun levenscyclus. Een nieuw cohort van IJs gevormd als reactie op voedselgebrek en overbevolking in het insectenkadaver duikt uiteindelijk op in de grond om te jagen op geschikte gastheren 9,10,11,12.

Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het onderhouden, versterken en genetisch manipuleren van EPN-nematoden. In het bijzonder schetst het protocol de replicatie van symbiotische H. bacteriophora en S. carpocapsae IJs, de generatie van axeenaaltjes-IJs, de productie van H. bacteriophora hermafrodieten voor micro-injectie, de bereiding van het dsRNA en de micro-injectietechniek. Deze methoden zijn essentieel voor het begrijpen van de moleculaire basis van pathpathogeniteit van nematoden en gastheer-anti-nematodenimmuniteit.