Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden
Summary
Entomopathogene Nematoden leben in Symbiose mit Bakterien und zusammen infizieren sie erfolgreich Insekten, indem sie ihr angeborenes Immunsystem untergraben. Um die Erforschung der genetischen Grundlagen der Nematodeninfektion zu fördern, werden Methoden zur Erhaltung und genetischen Manipulation entomopathogener Nematoden beschrieben.
Abstract
Entomopathogene Nematoden der Gattungen Heterorhabditis und Steinernema sind obligate Parasiten von Insekten, die im Boden leben. Das Hauptmerkmal ihres Lebenszyklus ist die mutualistische Assoziation mit den Bakterien Photorhabdus bzw. Xenorhabdus. Die Nematodenparasiten sind in der Lage, geeignete Insektenwirte zu lokalisieren und in sie einzudringen, die Immunantwort der Insekten zu untergraben und sich effizient zu vermehren, um die nächste Generation zu produzieren, die aktiv neue Insektenbeute jagen wird, um sie zu infizieren. Aufgrund der Eigenschaften ihres Lebenszyklus sind entomopathogene Nematoden beliebte biologische Bekämpfungsmittel, die in Kombination mit Insektiziden zur Bekämpfung zerstörerischer landwirtschaftlicher Insektenschädlinge eingesetzt werden. Gleichzeitig stellen diese parasitären Nematoden ein Forschungsinstrument zur Analyse der Nematodenpathogenität und der Anti-Nematoden-Reaktionen dar. Diese Forschung wird durch die jüngste Entwicklung genetischer Techniken und transkriptomischer Ansätze zum Verständnis der Rolle von Nematoden-sezernierten Molekülen während der Infektion unterstützt. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Aufrechterhaltung entomopathogener Nematoden und zur Verwendung eines Gen-Knockdown-Verfahrens bereitgestellt. Diese Methoden fördern die funktionelle Charakterisierung entomopathogener Nematodeninfektionsfaktoren.
Introduction
Die Forschung an entomopathogenen Nematoden (EPN) hat sich in den letzten Jahren vor allem aufgrund des Nutzens dieser Parasiten in integrierten Schädlingsbekämpfungsstrategien und ihrer Beteiligung an der biomedizinischen Grundlagenforschungintensiviert 1,2. Neuere Studien haben EPN als Modellorganismen etabliert, in denen die genetischen Komponenten des Fadenwurms untersucht werden können, die in den verschiedenen Stadien des Infektionsprozesses aktiviert werden. Diese Informationen liefern wichtige Hinweise auf die Art und Anzahl der Moleküle, die von den Parasiten abgesondert werden, um die Physiologie des Wirts zu verändern und die angeborene Immunantwort des Insekts zu destabilisieren 3,4. Gleichzeitig wird dieses Wissen häufig durch neue Details über die Art der Immunsignalwege des Insektenwirts und die Funktionen, die sie regulieren, um den Eintritt und die Ausbreitung der Krankheitserreger einzuschränken, ergänzt 5,6. Das Verständnis dieser Prozesse ist entscheidend, um sich beide Seiten des dynamischen Zusammenspiels zwischen EPN und ihren Insektenwirten vorzustellen. Eine bessere Wertschätzung der EPN-Insekten-Wirtsbeziehung wird zweifellos ähnliche Studien mit parasitären Nematoden von Säugetieren ermöglichen, die zur Identifizierung und Charakterisierung von Infektionsfaktoren führen können, die das menschliche Immunsystem stören.
Die EPN-Nematoden Heterorhabditis sp. und Steinernema sp. können eine Vielzahl von Insekten infizieren, und ihre Biologie wurde zuvor intensiv untersucht. Die beiden Nematodenparasiten unterscheiden sich in ihrer Fortpflanzungsweise, wobei Heterorhabditis selbstbefruchtet wird und Steinernema eine amphimiktische Fortpflanzung durchläuft, obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass sich S. hermaphroditum durch Selbstbefruchtung von Hermaphroditen oder durch Parthenogenesefortpflanzt 7,8,9. Ein weiterer Unterschied zwischen Heterorhabditis und Steinernema-Nematoden ist ihr symbiotischer Mutualismus mit zwei verschiedenen Gattungen gramnegativer Bakterien, Photorhabdus bzw. Xenorhabdus, die beide starke Krankheitserreger von Insekten sind. Diese Bakterien befinden sich im frei lebenden und nicht fütternden infektiösen Jungtierstadium (IJ) des EPN, das anfällige Wirte erkennt, Zugang zum Insektenhämocoel erhält, wo sie ihre assoziierten Bakterien freisetzen, die sich schnell replizieren, und Insektengewebe besiedeln. Sowohl das EPN als auch ihre Bakterien produzieren Virulenzfaktoren, die die Insektenabwehr entwaffnen und die Homöostase beeinträchtigen. Nach dem Insektentod entwickeln sich die Nematoden-IJs zu erwachsenen EPN und vervollständigen ihren Lebenszyklus. Eine neue Kohorte von IJs, die als Reaktion auf Nahrungsentzug und Überfüllung innerhalb des Insektenkadavers gebildet wurde, taucht schließlich im Boden auf, um geeignete Wirtezu jagen 9,10,11,12.
Hier wird ein effizientes Protokoll zur Erhaltung, Verstärkung und genetischen Manipulation von EPN-Nematoden beschrieben. Insbesondere beschreibt das Protokoll die Replikation von symbiotischen H. bacteriophora und S. carpocapsae IJs, die Erzeugung von axenischen Nematoden-IJs, die Produktion von H. bacteriophora Hermaphroditen für die Mikroinjektion, die Herstellung der dsRNA und die Mikroinjektionstechnik. Diese Methoden sind essentiell für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Nematodenpathogenität und der Anti-Nematoden-Immunität des Wirts.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verständnis der molekularen Grundlagen einer entomopathogenen Nematodeninfektion und der Insekten-Anti-Nematoden-Immunität erfordert die Trennung der Parasiten von den gegenseitig assoziierten Bakterien13,15,16. Die entomopathogenen Nematoden H. bacteriophora und S. carpocapsae leben zusammen mit den gramnegativen Bakterien P. luminescens bzw. X. nematophila 17. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Department of Biological Sciences der George Washington University für die kritische Lektüre des Manuskripts. Alle grafischen Figuren wurden mit BioRender erstellt. Forschung in den I. E., J. H. und D. O’H. Laboratorien wurden von der George Washington University und dem Columbian College of Arts and Sciences unterstützt, die Mittel und interdisziplinäre Forschungsfonds ermöglichen.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
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