תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות
Summary
נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.
Abstract
נמטודות אנטומופתוגניות בסוגים Heterorhabditis ו – Steinernema הם טפילים מחייבים של חרקים שחיים באדמה. המאפיין העיקרי של מחזור החיים שלהם הוא הקשר ההדדי עם החיידקים Photorhabdus ו Xenorhabdus, בהתאמה. טפילי הנמטודה מסוגלים לאתר ולהיכנס לפונדקאים מתאימים של חרקים, לחתור תחת התגובה החיסונית של החרקים ולהתרבות ביעילות כדי לייצר את הדור הבא שיצוד באופן פעיל טרף חרקים חדש להדבקה. בשל התכונות של מחזור החיים שלהם, נמטודות אנטומופתוגניות הן סוכני הדברה ביולוגית פופולריים, המשמשים בשילוב עם קוטלי חרקים להדברת מזיקים חקלאיים הרסניים. במקביל, נמטודות טפיליות אלה מייצגות כלי מחקר לניתוח פתוגניות של נמטודות ותגובות אנטי-נמטודיות מארחות. מחקר זה נעזר בפיתוח לאחרונה של טכניקות גנטיות וגישות תעתיק להבנת תפקידן של מולקולות מופרשות נמטודה במהלך זיהום. כאן, פרוטוקול מפורט על שמירה על נמטודות אנטומופתוגניות ושימוש בהליך פירוק גנים מסופק. מתודולוגיות אלה מקדמות עוד יותר את האפיון הפונקציונלי של גורמי זיהום נמטודות אנטומופתוגניים.
Introduction
המחקר על נמטודות אנטומופתוגניות (EPN) התעצם בשנים האחרונות בעיקר בשל התועלת של טפילים אלה באסטרטגיות משולבות של הדברה ומעורבותם במחקר ביו-רפואי בסיסי 1,2. מחקרים אחרונים ביססו את EPN כאורגניזמי מודל שבהם ניתן לבחון את המרכיבים הגנטיים של הנמטודה המופעלים בשלבים השונים של תהליך ההדבקה. מידע זה מספק רמזים קריטיים על טבען ומספר המולקולות המופרשות על ידי הטפילים כדי לשנות את הפיזיולוגיה של המארח ולערער את התגובה החיסונית המולדת של החרק 3,4. במקביל, ידע זה מתווספים בדרך כלל על ידי פרטים חדשים על סוג מסלולי האיתות החיסוניים של מארח החרקים ועל הפונקציות שהם מווסתים כדי להגביל את הכניסה וההתפשטות של הפתוגנים 5,6. הבנת התהליכים האלה חיונית כדי לדמיין את שני הצדדים של יחסי הגומלין הדינמיים בין EPN לבין מארחי החרקים שלהם. הערכה טובה יותר של הקשר בין EPN לחרקים מארחים תאפשר ללא ספק מחקרים דומים עם נמטודות טפיליות של יונקים, מה שעלול להוביל לזיהוי ואפיון של גורמי זיהום המפריעים למערכת החיסון האנושית.
נמטודות ה-EPN Heterorhabditis sp. ו-Steinernema sp. יכולות להדביק מגוון רחב של חרקים, והביולוגיה שלהם נחקרה באינטנסיביות בעבר. שני טפילי הנמטודה נבדלים זה מזה באופן הרבייה שלהם כאשר ההטרורהבדיטיס מופרה בעצמה ושטיינרנמה עוברת רבייה אמפימיקטית, אם כי לאחרונה הודגם כי S. hermaphroditum מתרבה על ידי הפריה עצמית של הרמפרודיטים או באמצעות פרתנוגנזה 7,8,9. הבדל נוסף בין הנמטודות ההטרורהבדיטיס לשטיינרנמה הוא ההדדיות הסימביוטית שלהם עם שני סוגים נפרדים של חיידקים גראם שליליים, פוטורהבדוס וקסנורהבדוס, בהתאמה, ששניהם פתוגנים חזקים של חרקים. חיידקים אלה נמצאים בשלב הצעירים הנגועים (IJ) של ה-EPN, אשר מזהים פונדקאים רגישים, מקבלים גישה להמוקול החרקים, שם הם משחררים את החיידקים הקשורים אליהם שמשתכפלים במהירות, ומיישבים רקמות חרקים. גם ה-EPN וגם החיידקים שלהם מייצרים גורמי אלימות שמפרקים את הגנות החרקים מנשקם ופוגעים בהומאוסטזיס. לאחר מות החרקים, הנמטודות IJs מתפתחות כדי להפוך ל-EPN בוגר ולהשלים את מחזור החיים שלהן. קבוצה חדשה של IJs שנוצרה בתגובה לחסך מזון וצפיפות יתר בתוך ציד החרקים סוף סוף מגיחה באדמה כדי לצוד פונדקאים מתאימים 9,10,11,12.
כאן מתואר פרוטוקול יעיל לשמירה, הגברה ומניפולציה גנטית של נמטודות EPN. בפרט, הפרוטוקול מתאר את השכפול של ה- H. bacteriophora ו- S. carpocapsae IJs הסימביוטיים, את הדור של נמטודה אקסנית IJs, את הייצור של H. bacteriophora hermaphrodites עבור microinjection, הכנת dsRNA, ואת טכניקת microinjection. שיטות אלה חיוניות להבנת הבסיס המולקולרי של פתוגניות נמטודה וחסינות מארחת נגד נמטודה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת הבסיס המולקולרי של זיהום נמטודות אנטומופתוגניות וחסינות חרקים נגד נמטודה דורשת הפרדת הטפילים מהחיידקים הקשורים הדדית 13,15,16. הנמטודות האנטומופתוגניות H. bacteriophora ו- S. carpocapsae חיות יחד עם החיידקים הגראם-שליליים P. luminescens ו- <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ג’ורג’ וושינגטון על הקריאה הביקורתית בכתב היד. כל הדמויות הגרפיות נעשו באמצעות BioRender. מחקר ב- I. E., J. H., ו- D. O’H. מעבדות נתמכו על ידי אוניברסיטת ג’ורג ‘ וושינגטון והמכללה הקולומביאנית לאמנויות ומדעים המסייעים לקרנות וקרנות מחקר בין-תחומיות.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
