Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni

La ricerca sui nematodi entomopatogeni (EPN) si è intensificata negli ultimi anni principalmente a causa dell’utilità di questi parassiti nelle strategie di gestione integrata dei parassiti e del loro coinvolgimento nella ricerca biomedica di base ^1,2. Recenti studi hanno stabilito l’EPN come organismi modello in cui esaminare le componenti genetiche dei nematodi che vengono attivate durante le diverse fasi del processo di infezione. Queste informazioni forniscono indizi critici sulla natura e il numero di molecole secrete dai parassiti per alterare la fisiologia dell’ospite e destabilizzare la risposta immunitaria innata dell’insetto ^3,4. Allo stesso tempo, questa conoscenza è comunemente integrata da nuovi dettagli sul tipo di vie di segnalazione immunitaria dell’ospite insetto e sulle funzioni che regolano per limitare l’ingresso e la diffusione dei patogeni ^5,6. Comprendere questi processi è fondamentale per immaginare entrambi i lati dell’interazione dinamica tra EPN e i loro ospiti di insetti. Un migliore apprezzamento della relazione EPN-insetto ospite faciliterà senza dubbio studi simili con i nematodi parassiti dei mammiferi, che possono portare all’identificazione e alla caratterizzazione dei fattori di infezione che interferiscono con il sistema immunitario umano.

I nematodi EPN Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. possono infettare una vasta gamma di insetti e la loro biologia è stata intensamente studiata in precedenza. I due parassiti nematodi differiscono nella loro modalità di riproduzione con Heterorhabditis autofecondata e Steinernema sottoposto a riproduzione anfimitica, anche se recentemente S. hermaphroditum ha dimostrato di riprodursi per autofecondazione di ermafroditi o attraverso la partenogenesi ^7,8,9. Un’altra differenza tra Heterorhabditis e Steinernema nematodes è il loro mutualismo simbiotico con due generi distinti di batteri Gram-negativi, rispettivamente Photorhabdus e Xenorhabdus, che sono entrambi potenti patogeni degli insetti. Questi batteri si trovano nello stadio giovanile infettivo (IJ) a vita libera e non alimentare dell’EPN, che rileva gli ospiti sensibili, ottiene l’accesso all’emocoel degli insetti dove rilasciano i loro batteri associati che si replicano rapidamente e colonizzano i tessuti degli insetti. Sia l’EPN che i loro batteri producono fattori di virulenza che disarmano le difese degli insetti e compromettono l’omeostasi. Dopo la morte degli insetti, gli IJ nematodi si sviluppano per diventare EPN adulti e completare il loro ciclo di vita. Una nuova coorte di IJ formata in risposta alla privazione di cibo e al sovraffollamento all’interno del cadavere degli insetti emerge finalmente nel terreno per cacciare ospiti adatti 9,10,11,12.

Qui viene descritto un protocollo efficiente per mantenere, amplificare e manipolare geneticamente i nematodi EPN. In particolare, il protocollo delinea la replicazione di H. bacteriophora simbiotici e S. carpocapsae IJ, la generazione di IJ di nematodi axenici, la produzione di Ermafroditi H. bacteriophora per la microiniezione, la preparazione del dsRNA e la tecnica di microiniezione. Questi metodi sono essenziali per comprendere le basi molecolari della patogenicità dei nematodi e dell’immunità anti-nematodi dell’ospite.