زراعة الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والتلاعب بها وراثيا
Summary
تعيش الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية في تكافل مع البكتيريا ومعا تصيب الحشرات بنجاح عن طريق تقويض جهاز المناعة الفطري لديها. لتعزيز البحوث على الأساس الجيني لعدوى الديدان الخيطية ، يتم وصف طرق للحفاظ على الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية ومعالجتها وراثيا.
Abstract
الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية في الأجناس Heterorhabditis و Steinernema هي طفيليات ملزمة للحشرات التي تعيش في التربة. السمة الرئيسية لدورة حياتها هي الارتباط المتبادل مع البكتيريا Photorhabdus و Xenorhabdus ، على التوالي. طفيليات الديدان الخيطية قادرة على تحديد موقع ودخول مضيفات الحشرات المناسبة ، وتخريب الاستجابة المناعية للحشرة ، والتكاثر بكفاءة لإنتاج الجيل التالي الذي سيطارد بنشاط فريسة حشرات جديدة للإصابة. نظرا لخصائص دورة حياتها ، فإن الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية هي عوامل مكافحة بيولوجية شائعة ، والتي تستخدم في تركيبة مع المبيدات الحشرية للسيطرة على الآفات الحشرية الزراعية المدمرة. وفي الوقت نفسه، تمثل هذه الديدان الخيطية الطفيلية أداة بحثية لتحليل إمراض الديدان الخيطية واستضافة الاستجابات المضادة للديدان الخيطية. ويساعد هذا البحث من خلال التطور الأخير للتقنيات الوراثية والنهج النسخية لفهم دور جزيئات الديدان الخيطية التي تفرز أثناء العدوى. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل حول الحفاظ على الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية واستخدام إجراء ضربة قاضية للجينات. وتعزز هذه المنهجيات التوصيف الوظيفي لعوامل عدوى الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية.
Introduction
تكثفت الأبحاث حول الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية (EPN) على مدى السنوات القليلة الماضية ويرجع ذلك في المقام الأول إلى فائدة هذه الطفيليات في استراتيجيات الإدارة المتكاملة للآفات ومشاركتها في البحوث الطبية الحيوية الأساسية 1,2. وقد أثبتت الدراسات الحديثة EPN ككائنات حية نموذجية لفحص المكونات الوراثية للديدان الخيطية التي يتم تنشيطها خلال المراحل المختلفة من عملية العدوى. توفر هذه المعلومات أدلة مهمة على طبيعة وعدد الجزيئات التي تفرزها الطفيليات لتغيير فسيولوجيا المضيف وزعزعة استقرار الاستجابة المناعية الفطرية للحشرة 3,4. في الوقت نفسه ، تستكمل هذه المعرفة عادة بتفاصيل جديدة حول نوع مسارات الإشارات المناعية لمضيف الحشرات والوظائف التي تنظمها لتقييد دخول وانتشار مسببات الأمراض 5,6. يعد فهم هذه العمليات أمرا بالغ الأهمية لتصور جانبي التفاعل الديناميكي بين EPN ومضيفيها من الحشرات. ومما لا شك فيه أن التقدير الأفضل للعلاقة بين مضيف الحشرات EPN والحشرات سيسهل إجراء دراسات مماثلة مع الديدان الخيطية الطفيلية للثدييات ، مما قد يؤدي إلى تحديد وتوصيف عوامل العدوى التي تتداخل مع جهاز المناعة البشري.
يمكن أن تصيب الديدان الخيطية EPN Heterorhabditis sp. و Steinernema sp. مجموعة واسعة من الحشرات ، وقد تمت دراسة بيولوجيتها بشكل مكثف سابقا. يختلف الطفيليان الخيطيان في طريقة تكاثرهما مع التهاب الهيتيرورابديتيس الذي يتم تخصيبه ذاتيا ويخضع شتاينرنما للتكاثر البرمائي ، على الرغم من أنه ثبت مؤخرا أن S. hermaphroditum يتكاثر عن طريق الإخصاب الذاتي للخنثى أو من خلال التوالد العذري 7,8,9. فرق آخر بين التهاب الديدان الخيطية Heterorhabditis و Steinernema هو تبادلهما التكافلي مع جنسين متميزين من البكتيريا سالبة الجرام ، Photorhabdus و Xenorhabdus ، على التوالي ، وكلاهما من مسببات الأمراض القوية للحشرات. تم العثور على هذه البكتيريا في مرحلة الأحداث المعدية الحية وغير المتغذية (IJ) من EPN ، والتي تكتشف المضيفين الحساسين ، والوصول إلى هيموكول الحشرات حيث تطلق البكتيريا المرتبطة بها التي تتكاثر بسرعة ، وتستعمر أنسجة الحشرات. ينتج كل من EPN والبكتيريا الخاصة بهم عوامل ضراوة تنزع سلاح دفاعات الحشرات وتضعف التوازن. بعد موت الحشرات ، تتطور الديدان الخيطية IJs لتصبح EPN بالغا وتكمل دورة حياتها. ظهرت أخيرا مجموعة جديدة من IJs التي تشكلت استجابة للحرمان من الطعام والاكتظاظ داخل جثة الحشرات في التربة لاصطياد المضيفين المناسبين9،10،11،12.
هنا ، يتم وصف بروتوكول فعال للحفاظ على نيماتودا EPN وتضخيمها ومعالجتها وراثيا. على وجه الخصوص ، يحدد البروتوكول تكرار H. bacteriophora و S. carpocapsae IJs التكافلية ، وتوليد الديدان الخيطية المحورية IJs ، وإنتاج H. bacteriophora hermaphrodites للحقن المجهري ، وإعداد dsRNA ، وتقنية الحقن المجهري. هذه الطرق ضرورية لفهم الأساس الجزيئي لإمراض الديدان الخيطية ومناعة المضيف المضادة للديدان الخيطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب فهم الأساس الجزيئي لعدوى الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والمناعة المضادة للنيماتودا الحشرية فصل الطفيليات عن البكتيريا المرتبطة بالتبادلية13،15،16. تعيش الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية H. bacteriophora و S. carpocapsae</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء قسم العلوم البيولوجية في جامعة جورج واشنطن على القراءة النقدية للمخطوطة. تم إجراء جميع الأشكال الرسومية باستخدام BioRender. بحث في I. E.، J. H.، و D. O’H. تم دعم المختبرات من قبل جامعة جورج واشنطن والكلية الكولومبية للفنون والعلوم لتسهيل الأموال وصناديق البحوث متعددة التخصصات.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
