Культивирование и генетическое манипулирование энтомопатогенными нематодами
Summary
Энтомопатогенные нематоды живут в симбиозе с бактериями и вместе они успешно заражают насекомых, подрывая их врожденную иммунную систему. Для содействия исследованиям генетической основы нематодной инфекции описаны методы поддержания и генетического манипулирования энтомопатогенными нематодами.
Abstract
Энтомопатогенные нематоды в родах Heterorhabditis и Steinernema являются облигатными паразитами насекомых, обитающих в почве. Основной характеристикой их жизненного цикла является мутуалистическая ассоциация с бактериями Photorhabdus и Xenorhabdus соответственно. Паразиты-нематоды способны находить и проникать в подходящих насекомых-хозяев, подрывать иммунный ответ насекомых и эффективно размножаться, чтобы произвести следующее поколение, которое будет активно охотиться на новую добычу насекомых для заражения. Благодаря свойствам своего жизненного цикла, энтомопатогенные нематоды являются популярными средствами биологического контроля, которые используются в сочетании с инсектицидами для борьбы с разрушительными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями. Одновременно эти паразитические нематоды представляют собой исследовательский инструмент для анализа патогенности нематод и реакций хозяина против нематод. Этому исследованию способствует недавняя разработка генетических методов и транскриптомных подходов для понимания роли молекул, секретируемых нематодами, во время инфекции. Здесь приведен подробный протокол по поддержанию энтомопатогенных нематод и использованию процедуры нокдауна генов. Эти методологии дополнительно способствуют функциональной характеристике энтомопатогенных факторов инфекции нематод.
Introduction
Исследования энтомопатогенных нематод (EPN) активизировались за последние несколько лет в первую очередь из-за полезности этих паразитов в комплексных стратегиях борьбы с вредителями и их участия в фундаментальных биомедицинских исследованиях 1,2. Недавние исследования установили EPN в качестве модельных организмов, в которых можно исследовать генетические компоненты нематод, которые активируются на разных стадиях инфекционного процесса. Эта информация дает критические подсказки о природе и количестве молекул, секретируемых паразитами, чтобы изменить физиологию хозяина и дестабилизировать врожденный иммунный ответ насекомых 3,4. В то же время эти знания обычно дополняются новыми подробностями о типе иммунных сигнальных путей насекомого-хозяина и функциях, которые они регулируют, чтобы ограничить проникновение и распространение патогенов 5,6. Понимание этих процессов имеет решающее значение для представления обеих сторон динамического взаимодействия между EPN и их насекомыми-хозяевами. Лучшая оценка отношений между EPN и насекомым-хозяином, несомненно, облегчит аналогичные исследования с паразитическими нематодами млекопитающих, что может привести к выявлению и характеристике инфекционных факторов, которые мешают иммунной системе человека.
Нематоды EPN Heterorhabditis sp. и Steinernema sp. могут заражать широкий спектр насекомых, и их биология была интенсивно изучена ранее. Два паразита-нематоды различаются по способу размножения: гетерорхабдит самооплодотворяется, а Steinernema подвергается амфимическому размножению, хотя недавно было показано, что S. hermaphroditum размножается путем самооплодотворения гермафродитов или партеногенеза 7,8,9. Другим отличием нематод Heterorhabditis и Steinernema является их симбиотический мутуализм с двумя различными родами грамотрицательных бактерий, Photorhabdus и Xenorhabdus, соответственно, которые являются мощными патогенами насекомых. Эти бактерии обнаруживаются на стадии свободноживущей и непитающейся инфекционной ювенильной (IJ) EPN, которая обнаруживает восприимчивых хозяев, получает доступ к гемокоэлю насекомых, где они высвобождают свои ассоциированные бактерии, которые быстро реплицируются, и колонизируют ткани насекомых. Как EPN, так и их бактерии производят факторы вирулентности, которые обезоруживают защиту насекомых и ухудшают гомеостаз. После смерти насекомых НЕМАТОДы развиваются, чтобы стать взрослыми EPN и завершить свой жизненный цикл. Новая когорта ИД, сформированная в ответ на лишение пищи и перенаселенность в трупе насекомых, наконец, появляется в почве, чтобы охотиться на подходящих хозяев 9,10,11,12.
Здесь описан эффективный протокол для поддержания, усиления и генетического манипулирования нематодами EPN. В частности, протокол описывает репликацию симбиотических H. bacteriophora и S. carpocapsae IJs, генерацию аксеновых нематод IJ, производство H. bacteriophora hermaphrodites для микроинъекции, получение дцРНК и технику микроинъекции. Эти методы необходимы для понимания молекулярной основы патогенности нематод и иммунитета хозяина против нематод.
Protocol
Representative Results
Discussion
Понимание молекулярной основы энтомопатогенной нематодной инфекции и иммунитета насекомых против нематод требует отделения паразитов от мутуалистически связанных бактерий 13,15,16. Энтомопатогенные нематоды H. bacteriophora и S. carpocapsae<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона за критическое прочтение рукописи. Все графические рисунки были сделаны с помощью BioRender. Исследования в I. E., J. H. и D. O’H. лаборатории были поддержаны Университетом Джорджа Вашингтона и Колумбийским колледжем искусств и наук, содействующими фондам и фондам междисциплинарных исследований.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
