Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes
Summary
Les nématodes entomopathogènes vivent en symbiose avec les bactéries et, ensemble, ils infectent avec succès les insectes en sapant leur système immunitaire inné. Pour promouvoir la recherche sur la base génétique de l’infection par les nématodes, des méthodes de maintien et de manipulation génétique des nématodes entomopathogènes sont décrites.
Abstract
Les nématodes entomopathogènes des genres Heterorhabditis et Steinernema sont des parasites obligatoires des insectes qui vivent dans le sol. La principale caractéristique de leur cycle de vie est l’association mutualiste avec les bactéries Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement. Les parasites nématodes sont capables de localiser et d’entrer dans des hôtes d’insectes appropriés, de subvertir la réponse immunitaire des insectes et de se multiplier efficacement pour produire la prochaine génération qui chassera activement de nouvelles proies d’insectes à infecter. En raison des propriétés de leur cycle de vie, les nématodes entomopathogènes sont des agents de lutte biologique populaires, qui sont utilisés en combinaison avec des insecticides pour lutter contre les insectes nuisibles agricoles destructeurs. Simultanément, ces nématodes parasites représentent un outil de recherche pour analyser la pathogénicité des nématodes et les réponses anti-nématodes de l’hôte. Cette recherche est facilitée par le développement récent de techniques génétiques et d’approches transcriptomiques pour comprendre le rôle des molécules sécrétées par les nématodes au cours de l’infection. Ici, un protocole détaillé sur le maintien des nématodes entomopathogènes et l’utilisation d’une procédure d’élimination des gènes est fourni. Ces méthodologies favorisent davantage la caractérisation fonctionnelle des facteurs d’infection par les nématodes entomopathogènes.
Introduction
La recherche sur les nématodes entomopathogènes (EPN) s’est intensifiée au cours des dernières années en raison principalement de l’utilité de ces parasites dans les stratégies de lutte intégrée contre les ravageurs et de leur implication dans la recherche biomédicale fondamentale 1,2. Des études récentes ont établi l’EPN comme organisme modèle dans lequel examiner les composants génétiques des nématodes qui sont activés au cours des différentes étapes du processus d’infection. Ces informations fournissent des indices critiques sur la nature et le nombre de molécules sécrétées par les parasites pour modifier la physiologie de l’hôte et déstabiliser la réponse immunitaire innée des insectes 3,4. Simultanément, ces connaissances sont généralement complétées par de nouveaux détails sur le type de voies de signalisation immunitaire de l’insecte hôte et les fonctions qu’elles régulent pour restreindre l’entrée et la propagation des agents pathogènes 5,6. Comprendre ces processus est crucial pour envisager les deux côtés de l’interaction dynamique entre l’EPN et leurs hôtes insectes. Une meilleure appréciation de la relation EPN-insecte hôte facilitera sans aucun doute des études similaires avec des nématodes parasites de mammifères, ce qui peut conduire à l’identification et à la caractérisation des facteurs d’infection qui interfèrent avec le système immunitaire humain.
Les nématodes EPN Heterorhabditis sp. et Steinernema sp. peuvent infecter un large éventail d’insectes, et leur biologie a été intensément étudiée précédemment. Les deux parasites nématodes diffèrent dans leur mode de reproduction, Heterorhabditis étant autofertilisé et Steinernema subissant une reproduction amphimique, bien que récemment S. hermaphroditum se reproduise par auto-fécondation d’hermaphrodites ou par parthénogenèse 7,8,9. Une autre différence entre les nématodes Heterorhabditis et Steinernema est leur mutualisme symbiotique avec deux genres distincts de bactéries à Gram négatif, Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement, qui sont tous deux de puissants agents pathogènes des insectes. Ces bactéries se trouvent au stade juvénile infectieux (IJ) vivant librement et non nourrissant de l’EPN, qui détectent les hôtes sensibles, accèdent à l’hémocèle d’insecte où ils libèrent leurs bactéries associées qui se répliquent rapidement et colonisent les tissus des insectes. L’EPN et leurs bactéries produisent des facteurs de virulence qui désarment les défenses des insectes et nuisent à l’homéostasie. Après la mort des insectes, les SI nématodes se développent pour devenir des EPN adultes et compléter leur cycle de vie. Une nouvelle cohorte d’IJ formée en réponse à la privation de nourriture et à la surpopulation dans le cadavre d’insectes émerge finalement dans le sol pour chasser les hôtes appropriés 9,10,11,12.
Ici, un protocole efficace pour maintenir, amplifier et manipuler génétiquement les nématodes EPN est décrit. En particulier, le protocole décrit la réplication des IJ symbiotiques de H. bacteriophora et de S. carpocapsae , la génération de nématodes inématiques, la production d’hermaphrodites de H. bacteriophora pour la microinjection, la préparation de l’ARNds et la technique de microinjection. Ces méthodes sont essentielles pour comprendre la base moléculaire de la pathogénicité des nématodes et l’immunité anti-nématodes de l’hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendre la base moléculaire de l’infection par les nématodes entomopathogènes et de l’immunité anti-nématodes des insectes nécessite la séparation des parasites des bactéries associées mutuellement 13,15,16. Les nématodes entomopathogènes H. bacteriophora et S. carpocapsae vivent respectivement avec les bactéries à Gram négatif P. luminescens et X. nematophila,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington pour leur lecture critique du manuscrit. Toutes les figures graphiques ont été réalisées à l’aide de BioRender. Recherche dans l’I. E., J. H., et D. O’H. les laboratoires ont été soutenus par l’Université George Washington et le Columbian College of Arts and Sciences, facilitant les fonds et les fonds de recherche interdisciplinaires.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
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