Ex Vivo Nörofizyoloji için Sıçan Siyatik Sinirinin Hazırlanması
Summary
Bu protokol, sıçan tüm siyatik sinir dokusunun ex vivo elektrofizyolojik stimülasyon için hazırlanmasını ve çevresel olarak düzenlenmiş, iki bölmeli, perfüze edilmiş bir salin banyosunda kaydedilmesini açıklar.
Abstract
Ex vivo preparatlar, lokal doku yapısını korurken vücudun geri kalanından izole olarak birçok nörofizyolojik sürecin incelenmesini sağlar. Bu çalışma, tampon preparatı, hayvan prosedürleri, ekipman kurulumu ve nörofizyolojik kayıt dahil olmak üzere ex vivo nörofizyoloji için sıçan siyatik sinirlerinin hazırlanmasını açıklamaktadır. Bu çalışma, bu yöntemle mümkün olan farklı deney türlerine genel bir bakış sunmaktadır. Özetlenen yöntem, sonuçlarda optimal tutarlılık için sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullarda ekstrakte edilen periferik sinir dokusu üzerinde 6 saatlik stimülasyon ve kayıt sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçlar, deneyin tüm süresi boyunca milivolt aralığında tepeden tepeye genliklere sahip A-fiber bileşik aksiyon potansiyelleridir (CAP). CAP genlikleri ve şekilleri tutarlı ve güvenilirdir, bu da onları yeni elektrotları mevcut modellerle veya kimyasalların kullanımı, cerrahi değişiklikler veya nöromodülatör stimülasyon teknikleri gibi müdahalelerin doku üzerindeki etkilerini test etmek ve karşılaştırmak için yararlı kılar. Hem platin-iridyum kontaktlı geleneksel manşet elektrotları hem de ısmarlama iletken elastomer elektrotlar test edilmiş ve sinir uyaranı kuvvet-süre yanıtı açısından benzer sonuçlar vermiştir.
Introduction
Siliko modellenmiş olarak temel sinir fonksiyonunun mevcut anlayışı, özellikle soma, akson ve dendritlerin dışındaki sinir dokusu bölümlenmesinin etkileri ile ilgili olarak, birçok açıdan eksiktir. Akson-miyelin etkileşimleri, geleneksel elektriksel stimülasyon yanıtını yeterince yakalayan MRG1 (memeli sinirleri için) gibi ayrıntılı hesaplamalı sinir modellerinin bile, yüksek frekanslı blok taşıma2 veya ikincil başlangıçlı yanıt3 gibi deneysel olarak gözlemlenen diğer davranışları yakalamadığı gerçeğiyle kanıtlandığı gibi hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Bu protokol, siniri izole etmek, çevresini kontrol etmek ve in vivo bağlamdan ex vivo bir bağlama çıkarmak için standartlaştırılmış bir hazırlık protokolü kullanarak, akut küçük bir laboratuvar hayvanı modelinde sinir düzeyinde nörofizyolojik süreçleri verimli bir şekilde araştırmak için bir yöntem sağlar. Bu, in vivo sinir stimülasyon protokolleri tarafından kullanılan diğer vücut süreçlerini veya anesteziklerin sinir davranışını değiştirmesini ve ölçülen sonuçları veya bunların yorumlanmasını karıştırmasını önleyecektir 4,5. Bu, yalnızca az anlaşılmış sinir dokularına özgü etkilere odaklanan daha gerçekçi modellerin geliştirilmesini sağlar. Bu protokol aynı zamanda yeni sinir stimülasyonu ve elektrot materyallerinin ve geometrilerinin yanı sıra yüksek frekanslı blok 2,3 gibi yeni stimülasyon paradigmaları için bir test yatağı olarak da yararlıdır. Bu tekniğin varyasyonları daha önce sıkı kontrol edilen koşullarda sinir fizyolojisini incelemek için kullanılmıştır6, örneğin, iyon kanalı dinamiklerini ve özelliklerini veya lokal anesteziklerin etkilerini ölçmekiçin 7.
Bu teknik, akut in vivo küçük hayvan deneyleri8 gibi alternatiflere kıyasla çeşitli avantajlar sağlar. Teknik, doku vücuttan çıkarıldığı için anestezi derinliğini koruma ihtiyacını ortadan kaldırır ve anestezik difüzör, oksijen konsantratör ve ısıtma yastığı gibi gerekli ekipman miktarını azaltır. Bu, deneysel protokolü basitleştirerek hata riskini azaltır. Anestezikler potansiyel olarak sinir fonksiyonunudeğiştirebildiğinden 4, bu teknik, önlemlerin bu anestezik bileşiklerin yan etkileriyle karıştırılmamasını sağlar. Son olarak, bu teknik, anestezi uygulanmış bir hayvanı felç yoluyla öldürecek olan tetrodotoksin gibi nörotoksik bileşiklerin etkilerini incelerken akut in vivo deneylerden daha uygundur.
Periferik sinir kesitleri benzersiz bir ex vivo sistemdir, çünkü kaydedilen nöral sinyallerden sorumlu liflerin herhangi bir soma içermeme olasılığı yüksektir. Bunlar normalde motor nöronlar için, omurgada ve omurganın yanındaki dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöronlar için yerleştirileceği için, memeli sinirinin bir bölümünün hazırlanması, kabaca, her iki ucunda da açık olan iyon kanallarına sahip boru şeklindeki zarların bir koleksiyonu olarak modellenebilir9. Metabolizma, doku diseksiyonu10 sırasında aksonda bulunan mitokondri tarafından korunur. Aksolemmanın açık uçlarının dikilmesi, ekstraksiyondan sonra onları kapatmak için teşvik edilir ve böylece normal sinir fonksiyonu için gerekli olan membran boyunca mevcut iyonik gradyanların korunmasına yardımcı olur.
Doku homeostazını vücudun dışında tutmak için, çeşitli çevresel değişkenler sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bunlar sıcaklık11, oksijenasyon 12, ozmolarite, pH13,14 ve metabolizmayı korumak için glikoza erişimdir. Bu protokol için yaklaşım, oksijen ve karbondioksit karışımı ile sürekli olarak havalandırılan modifiye edilmiş bir Krebs-Henseleit tamponu 15,16 (mKHB) kullanmaktır. mKHB, örneğin ex vivo deneylerde, vücut dışındaki disseke dokuları korumak için kullanılan kardiyoplejik tamponlar 6,17 ailesindedir. Bu tamponlar herhangi bir hemoglobin, antibiyotik veya antifungal içermez ve bu nedenle yalnızca sınırlı bir süre için az miktarda doku içeren preparatlar için uygundur. pH kontrolü, pH dengesini korumak için tamponun karbondioksit ile sürekli havalandırılmasını gerektiren karbonat ve karbondioksit redoks çifti ile sağlanmıştır. Bu, sinir hücresi fonksiyonunu değiştirebilen HEPES gibi diğer yaygın tamponlama ajanlarını kullanmaktan kaçınmaktır18. Tamponu oksijenlendirmek ve pH kontrolünü sağlamak için, karbojen adı verilen oksijende% 5 karbondioksit karışımı (% 95 O 2,% 5 CO2) kullanılmıştır. Bir tampon kabının sıcaklık kontrolü için bir ısıtma karıştırıcısı kullanıldı ve tampon bir sinir banyosundan geçirildi ve daha sonra başlangıç kabına yeniden dolaştırıldı. Tipik bir deney, sinir canlılığını kaybetmeden ve artık sağlıklı dokuyu temsil edecek önlemler için stimülasyona yeterince yanıt vermeden önce 6-8 saat sürecektir.
Sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, daha önce açıklanan yöntemlere göre hazırlanan kayıt için gümüş-klorür elektrotları kullanılmıştır19. Stimülasyon için, ticari kullanıma hazır platin manşet elektrotları ve özel yapım iletken polimer manşet elektrotlarının bir kombinasyonu kullanılabilir. İletken polimer manşet elektrotları, yüksek genlikli dalga formları20 kullanarak siniri uyarırken yararlı olan özellikle daha yüksek şarj kapasitelerine sahiptir.
Bu protokolde kullanılan uyarıcı daha önce20 olarak tanımlanmıştır. Kullanılacak belgeler, tasarım dosyaları ve yazılım komut dosyaları herkese açıktır21. Bu protokolü yürütmek için diğer uyarıcılar kullanılabilir; Bununla birlikte, özel stimülatör aynı zamanda daha geniş bir nörofizyoloji deneyi yelpazesine olanak tanıyan yüksek frekanslı alternatif akım (HFAC) blok 2,20 yeteneğine de sahiptir. HFAC bloğunu kullanmak için, sinirin zarar görmesini önlemek için iletken elastomer manşetler önerilir. İletken elastomer sinir manşetleri, iletken bileşen olarak iletken elastomerlerden ve yalıtım olarak polidimetilsiloksandan üretilen yumuşak ve tamamen polimerik elektrot dizileridir22. Cihazlar, geleneksel lazer mikrofabrikasyon teknikleri kullanılarak bipolar konfigürasyonda üretildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, sıçan siyatik sinirlerini ex vivo nörofizyolojiye hazırlamak için bir protokol tanımladık. Doku ekstraksiyonu, hayvan taşıma, anestezi, itlaf ve diseksiyon dahil olmak üzere yaklaşık 30 dakika sürerken, sinir temizliği, banyoya yerleştirme ve elektrot implantasyonu, kayda başlamadan önce 30 dakika daha gerektirmelidir. Tampon hazırlığı 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyin geri kalanından önce yapılabilir. Bu tür bir hazırlık ve deney, benzer tampo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Prusya Kralı, PA, ABD ve Galvani Bioelectronics’ten (Stevenage, İngiltere) Dr. Gerald Hunsberger’e orijinal sinir hazırlama tekniklerini bizimle paylaştıkları için teşekkür eder. Yazarlar, Çift Odacıklı sinir banyosu tasarımı için Robert Toth’u kabul ediyor. Yazarlar, Mühendislik ve Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi’nin (EPSRC) Sağlık Teknolojileri Mücadelesi Ödülleri (HTCA) hibesinden gelen finansmanı kabul etmektedir. Yazarlar, Adrien Rapeaux’yu (EP / L016796 / 1) finanse etmek için Imperial College London’ın Yüksek Performanslı Gömülü ve Dağıtılmış Sistemler Doktora Eğitimi Merkezi’ni (HiPEDS CDT) kabul etmektedir. Adrien Rapeaux şu anda İngiltere Demans Araştırma Enstitüsü, Bakım Araştırma ve Teknoloji Merkezi tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, JoVE video makalesinin üretimi sırasında deneyler ve hayvan dokularına erişim konusunda yardım için Imperial College’dan Zack Bailey’e Biyomühendislik Bölümü’nden minnetle teşekkür ediyor.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
