Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

A compreensão atual da função nervosa fundamental modelada no sílico está em falta em vários aspectos, notadamente no que diz respeito aos efeitos da compartimentação do tecido nervoso fora da soma, axônio e dendritos. As interações axon-mielina ainda são mal compreendidas como evidenciadas pelo fato de que mesmo modelos detalhados de nervo computacional, como o MRG¹ (para nervos mamíferos) que captam adequadamente a resposta convencional de estimulação elétrica, não capturam outros comportamentos experimentalmente observados, como o transporte de blocos de alta frequência² ou a resposta de início secundário³.

Este protocolo fornece um método para investigar eficientemente processos neurofisiológicos ao nível nervoso em um pequeno modelo animal de laboratório agudo, utilizando um protocolo de preparação padronizado para isolar o nervo, controlar seu ambiente e removê-lo de um contexto in vivo para um contexto ex vivo. Isso evitará outros processos corporais ou anestésicos usados por protocolos de estimulação nervosa in vivo para alterar o comportamento nervoso e confundir resultados medidos ou sua interpretação ^4,5. Isso permite o desenvolvimento de modelos mais realistas focando apenas em efeitos específicos para tecidos nervosos que são mal compreendidos. Este protocolo também é útil como um teste para novos materiais e geometrias de estimulação nervosa e gravação, bem como novos paradigmas de estimulação, como o bloco de alta frequência ^2,3. Variações dessa técnica têm sido utilizadas anteriormente para estudar fisiologia nervosa em condições bem controladas⁶, por exemplo, para medir a dinâmica e propriedades do canal de íons ou os efeitos dos anestésicos locais⁷.

Esta técnica oferece várias vantagens em comparação com alternativas como a experimentação aguda in vivo de pequenos animais⁸. A técnica evita a necessidade de manter a profundidade da anestesia, uma vez que o tecido foi extraído do corpo, reduzindo a quantidade de equipamentos necessários, como difusor anestésico, concentrador de oxigênio e almofada de aquecimento. Isso simplifica o protocolo experimental, reduzindo o risco de erros. Como os anestésicos podem potencialmente alterar a função nervosa⁴, esta técnica garante que as medidas não serão confundidas por efeitos colaterais desses compostos anestésicos. Finalmente, essa técnica é mais apropriada do que experimentos in vivo agudos ao estudar os efeitos de compostos neurotóxicos como a tetrodotoxina, que mataria um animal anestesiado por paralisia.

As seções nervosas periféricas são um sistema ex vivo único, pois há uma grande chance de que as fibras responsáveis pelos sinais neurais registrados não contenham nenhuma soma. Como estes normalmente seriam localizados, para neurônios motores, na coluna vertebral, e para neurônios sensoriais no gânglio dorsal ao lado da coluna vertebral, a preparação de uma seção do nervo mamífero pode ser aproximadamente modelada como uma coleção de membranas tubulares com canais de íons, abertas em ambas as extremidades⁹. O metabolismo é mantido pelas mitocôndrias localizadas no axônio no momento da dissecação tecidual¹⁰. A sutura das extremidades abertas do axolemma é encorajada após a extração para fechá-las e, assim, ajudar a manter os gradientes iônicos existentes em toda a membrana, que são essenciais para a função nervosa normal.

Para manter a homeostase tecidual fora do corpo, várias variáveis ambientais devem ser fortemente controladas. São^{temperaturas 11}, oxigenação¹², osmolaridade, pH^13,14 e acesso à glicose para manter o metabolismo. Para este protocolo, a abordagem é usar um buffer Krebs-Henseleit modificado ^15,16 (mKHB) continuamente arejado com uma mistura de oxigênio e dióxido de carbono. O mKHB está na família de tampões cardioplégicos ^6,17 usados para preservar tecidos dissecados fora do corpo, por exemplo, em experimentos ex vivo. Estes tampões não contêm hemoglobina, antibióticos ou antifúngicos e são, portanto, adequados apenas para preparações envolvendo pequenas quantidades de tecido por um tempo limitado. o controle de pH foi alcançado com o par de carbonato e dióxido de carbono redox, exigindo aeração constante do tampão com dióxido de carbono para manter o equilíbrio do pH. Isto é para evitar o uso de outros agentes de buffering comuns, como o HEPES, que pode modificar a função da célula nervosa¹⁸. Para oxigenar o tampão e fornecer controle de pH, foi utilizada uma mistura de 5% de dióxido de carbono em oxigênio chamado carbogen (95% O₂, 5% CO₂). Um agitador de aquecimento foi usado para o controle de temperatura de um recipiente tampão, e o tampão foi perfundido através de um banho nervoso, e depois recirculado para o recipiente de partida. Um experimento típico duraria de 6-8 h antes que o nervo perca sua viabilidade e não responda mais o suficiente à estimulação de medidas representativas do tecido saudável.

Para otimizar a relação sinal-ruído, foram utilizados eletrodos de cloreto de prata para gravação, que foram preparados de acordo com os métodos descritos anteriormente¹⁹. Para estimulação, uma combinação de eletrodos comerciais de punho de platina fora da prateleira e eletrodos de manguitos condutores personalizados podem ser usados. Os eletrodos condutores do manguito de polímero têm capacidades de carga notavelmente mais elevadas, que são úteis ao estimular o nervo usando formas de onda de alta amplitude²⁰.

O estimulador utilizado neste protocolo foi descrito anteriormente²⁰. Documentação, arquivos de design e scripts de software para usá-lo estão disponíveis publicamente²¹. Outros estimuladores podem ser usados para executar este protocolo; no entanto, o estimulador personalizado também é capaz de bloquear ^2,20 blocos de corrente alternativa de alta frequência (HFAC), que permite uma gama mais ampla de experimentos de neurofisiologia. Para usar o bloco HFAC, recomenda-se que as algemas elastômeras condutoras evitem danos ao nervo. As algemas hemóstulas condutoras são matrizes de eletrodos suaves e totalmente poliméricas produzidas a partir de elastômeros condutivos como componente condutor e polidimtilsiloxano como o isolamento²². Os dispositivos foram fabricados em uma configuração bipolar utilizando técnicas convencionais de microfabização a laser.