Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Das derzeitige Verständnis der grundlegenden Nervenfunktion, wie sie in silico modelliert wird, fehlt in mehreren Aspekten, insbesondere in Bezug auf die Auswirkungen der Kompartimentierung von Nervengewebe außerhalb des Somas, Axons und der Dendriten. Axon-Myelin-Wechselwirkungen sind immer noch wenig verstanden, wie die Tatsache zeigt, dass selbst detaillierte Computernervenmodelle wie MRG¹ (für Säugetiernerven), die die konventionelle elektrische Stimulationsreaktion angemessen erfassen, andere experimentell beobachtete Verhaltensweisen wie Hochfrequenz-Blockübertragung^{2 oder sekundäre} Beginnantwort³ nicht erfassen.

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um neurophysiologische Prozesse auf Nervenebene in einem akuten Kleinlabortiermodell effizient zu untersuchen, wobei ein standardisiertes Vorbereitungsprotokoll verwendet wird, um den Nerv zu isolieren, seine Umgebung zu kontrollieren und ihn aus einem In-vivo-Kontext in einen Ex-vivo-Kontext zu entfernen. Dies verhindert andere Körperprozesse oder Anästhetika, die von In-vivo-Nervenstimulationsprotokollen verwendet werden, um das Nervenverhalten zu verändern und die Messergebnisse oder deren Interpretation zu verfälschen ^4,5. Dies ermöglicht die Entwicklung realistischerer Modelle, die sich ausschließlich auf Effekte konzentrieren, die für Nervengewebe spezifisch sind und kaum verstanden werden. Dieses Protokoll ist auch als Testumgebung für neue Nervenstimulation und Aufzeichnung von Elektrodenmaterialien und -geometrien sowie für neue Stimulationsparadigmen wie Hochfrequenzblock ^2,3 nützlich. Variationen dieser Technik wurden zuvor verwendet, um die Nervenphysiologie unter streng kontrollierten Bedingungen zu untersuchen⁶, zum Beispiel um die Dynamik und Eigenschaften von Ionenkanälen oder die Auswirkungen von Lokalanästhetika zu messen⁷.

Diese Technik bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu Alternativen wie akuten In-vivo-Kleintierversuchen ⁸. Die Technik macht es überflüssig, die Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten, da das Gewebe aus dem Körper extrahiert wurde, wodurch die erforderliche Ausrüstung wie ein Anästhesiediffusor, ein Sauerstoffkonzentrator und ein Heizkissen reduziert werden. Dies vereinfacht das experimentelle Protokoll und reduziert das Risiko von Fehlern. Da Anästhetika möglicherweise die Nervenfunktion⁴ verändern können, stellt diese Technik sicher, dass die Maßnahmen nicht durch Nebenwirkungen dieser Anästhesieverbindungen beeinträchtigt werden. Schließlich ist diese Technik besser geeignet als akute In-vivo-Experimente , wenn die Auswirkungen neurotoxischer Verbindungen wie Tetrodotoxin untersucht werden, die ein betäubtes Tier durch Lähmung töten würden.

Periphere Nervenabschnitte sind ein einzigartiges Ex-vivo-System , da eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Fasern, die für aufgezeichnete neuronale Signale verantwortlich sind, kein Soma enthalten. Da sich diese normalerweise für Motoneuronen in der Wirbelsäule und für sensorische Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien neben der Wirbelsäule befinden würden, kann die Vorbereitung eines Abschnitts des Säugetiernervs grob als eine Ansammlung von röhrenförmigen Membranen mit Ionenkanälen modelliert werden, die an beiden Enden offen sind⁹. Der Stoffwechsel wird durch die Mitochondrien aufrechterhalten, die sich zum Zeitpunkt der Gewebedissektion¹⁰ im Axon befinden. Das Nähen der offenen Enden des Axolemmas wird nach der Extraktion angeregt, um sie zu schließen und dadurch dazu beizutragen, bestehende ionische Gradienten über die Membran aufrechtzuerhalten, die für eine normale Nervenfunktion unerlässlich sind.

Um die Gewebehomöostase außerhalb des Körpers aufrechtzuerhalten, müssen mehrere Umweltvariablen streng kontrolliert werden. Dies sind Temperatur 11, Sauerstoffversorgung¹², Osmolarität, pH^13,14 und Zugang zu Glukose^, um den Stoffwechsel aufrechtzuerhalten. Für dieses Protokoll besteht der Ansatz darin, einen modifizierten Krebs-Henseleit-Puffer^15,16 (mKHB) zu verwenden^, der kontinuierlich mit einer Mischung aus Sauerstoff und Kohlendioxid belüftet wird. Das mKHB gehört zur Familie der kardioplegikaischen Puffer ^6,17, die zur Konservierung von seziertem Gewebe außerhalb des Körpers verwendet werden, beispielsweise in Ex-vivo-Experimenten. Diese Puffer enthalten kein Hämoglobin, keine Antibiotika oder Antimykotika und eignen sich daher nur für Präparate, bei denen kleine Gewebemengen für eine begrenzte Zeit verwendet werden. Die pH-Kontrolle wurde mit dem Karbonat- und Kohlendioxid-Redoxpaar erreicht, was eine ständige Belüftung des Puffers mit Kohlendioxid erfordert, um das pH-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten. Dies dient dazu, die Verwendung anderer gängiger Puffermittel wie HEPES zu vermeiden, die die Nervenzellfunktion¹⁸ modifizieren können. Um den Puffer mit Sauerstoff zu versorgen und den pH-Wert zu kontrollieren, wurde eine Mischung aus 5% Kohlendioxid in Sauerstoff namens Carbogen (95%_O2, 5% CO₂) verwendet. Ein Heizrührer wurde zur Temperaturregelung eines Pufferbehälters verwendet, und der Puffer wurde durch ein Nervenbad perfundiert und dann in den Startbehälter zurückgeführt. Ein typisches Experiment würde 6-8 Stunden dauern, bevor der Nerv seine Lebensfähigkeit verliert und nicht mehr ausreichend auf die Stimulation anspricht, um Maßnahmen zu ergreifen, die für gesundes Gewebe repräsentativ sind.

Zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses wurden für die Aufzeichnung Silberchlorid-Elektroden verwendet, die nach zuvor beschriebenen Verfahren¹⁹ hergestellt wurden. Zur Stimulation kann eine Kombination aus handelsüblichen Platin-Manschettenelektroden und maßgeschneiderten leitfähigen Polymer-Manschettenelektroden verwendet werden. Leitfähige Polymermanschettenelektroden haben deutlich höhere Ladungskapazitäten, die bei der Stimulation des Nervs mit Wellenformen mit hoher Amplitude^{nützlich sind 20}.

Der in diesem Protokoll verwendete Stimulator wurde zuvor^{beschrieben 20}. Dokumentation, Entwurfsdateien und Softwareskripte für die Verwendung sind öffentlich verfügbar²¹. Andere Stimulatoren können verwendet werden, um dieses Protokoll auszuführen; Der kundenspezifische Stimulator ist jedoch auch in der Lage, den HFAC-Block ^2,20 (High Frequency Alternative Current) zu bilden, was ein breiteres Spektrum an neurophysiologischen Experimenten ermöglicht. Um HFAC-Block zu verwenden, werden leitfähige Elastomermanschetten empfohlen, um eine Schädigung des Nervs zu vermeiden. Leitfähige Elastomer-Nervenmanschetten sind weiche und vollständig polymere Elektrodenarrays, die aus leitfähigen Elastomeren als leitfähige Komponente und Polydimethylsiloxan als Isolierung²² hergestellt werden. Die Geräte wurden in einer bipolaren Konfiguration unter Verwendung herkömmlicher Laser-Mikrofabrikationstechniken hergestellt.