تحضير العصب الوركي للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي

إن الفهم الحالي لوظيفة الأعصاب الأساسية كما هو موضح في silico يفتقر إلى عدة جوانب ، لا سيما فيما يتعلق بآثار تفتيت الأنسجة العصبية خارج السوما والمحور العصبي والتشعبات. لا تزال التفاعلات بين المحور العصبي والمايلين غير مفهومة بشكل جيد كما يتضح من حقيقة أنه حتى نماذج الأعصاب الحسابية التفصيلية مثل MRG¹ (لأعصاب الثدييات) التي تلتقط بشكل كاف استجابة التحفيز الكهربائي التقليدية ، لا تلتقط السلوكيات الأخرى المرصودة تجريبيا مثل ترحيل الكتلة عالية التردد² أو استجابة البداية الثانوية³.

يوفر هذا البروتوكول طريقة للتحقيق بكفاءة في العمليات الفسيولوجية العصبية على مستوى الأعصاب في نموذج حيواني مختبري صغير حاد ، باستخدام بروتوكول إعداد موحد لعزل العصب ، والتحكم في بيئته ، وإزالته من سياق في الجسم الحي إلى سياق خارج الجسم الحي. هذا سيمنع عمليات الجسم الأخرى أو التخدير المستخدم من قبل بروتوكولات تحفيز الأعصاب في الجسم الحي لتغيير سلوك الأعصاب وإرباك النتائج المقاسة أو تفسيرها ^4,5. وهذا يمكن من تطوير نماذج أكثر واقعية تركز فقط على التأثيرات الخاصة بالأنسجة العصبية غير المفهومة بشكل جيد. هذا البروتوكول مفيد أيضا كمنصة اختبار لتحفيز الأعصاب الجديدة وتسجيل مواد القطب الكهربائي وهندسته ، بالإضافة إلى نماذج التحفيز الجديدة مثل الكتلة عالية التردد ^2,3. تم استخدام اختلافات في هذه التقنية سابقا لدراسة فسيولوجيا الأعصاب في ظروف خاضعة لرقابة مشددة⁶ ، على سبيل المثال ، لقياس ديناميكيات وخصائص القناة الأيونية أو آثار التخدير الموضعي⁷.

توفر هذه التقنية العديد من المزايا مقارنة بالبدائل مثل التجارب الحادة في الجسم الحي على الحيوانات الصغيرة⁸. تغني هذه التقنية عن الحاجة إلى الحفاظ على عمق التخدير حيث تم استخراج الأنسجة من الجسم ، مما يقلل من كمية المعدات المطلوبة مثل ناشر مخدر ، ومكثف الأكسجين ، ووسادة التدفئة. هذا يبسط البروتوكول التجريبي ، مما يقلل من خطر الأخطاء. نظرا لأن التخدير يمكن أن يغير وظيفة الأعصاب⁴ ، فإن هذه التقنية تضمن عدم الخلط بين التدابير بسبب الآثار الجانبية لهذه المركبات المخدرة. وأخيرا ، هذه التقنية أكثر ملاءمة من التجارب الحادة في الجسم الحي عند دراسة آثار المركبات السامة للأعصاب مثل التيترودوتوكسين ، والتي من شأنها أن تقتل حيوانا مخدرا عن طريق الشلل.

أقسام الأعصاب المحيطية هي نظام فريد من نوعه خارج الجسم الحي لأن هناك فرصة كبيرة لأن الألياف المسؤولة عن الإشارات العصبية المسجلة لا تحتوي على أي سوما. وبما أن هذه الخلايا عادة ما تكون موجودة ، بالنسبة للخلايا العصبية الحركية ، في العمود الفقري ، وللخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية بجوار العمود الفقري ، يمكن نمذجة إعداد جزء من عصب الثدييات تقريبا كمجموعة من الأغشية الأنبوبية ذات القنوات الأيونية ، المفتوحة في كلا الطرفين⁹. يتم الحفاظ على التمثيل الغذائي بواسطة الميتوكوندريا الموجودة في المحور العصبي في وقت تشريح الأنسجة¹⁰. يتم تشجيع خياطة الأطراف المفتوحة للمحور بعد الاستخراج لإغلاقها وبالتالي المساعدة في الحفاظ على التدرجات الأيونية الموجودة عبر الغشاء ، والتي تعتبر ضرورية لوظيفة الأعصاب الطبيعية.

للحفاظ على توازن الأنسجة خارج الجسم ، يجب التحكم في العديد من المتغيرات البيئية بإحكام. هذه هي درجة الحرارة¹¹ ، الأوكسجين 12 ، الأسمولية ، الرقم الهيدروجيني^13,14 ، والوصول إلى الجلوكوز للحفاظ على التمثيل الغذائي. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتمثل النهج في استخدام مخزن مؤقت معدل Krebs-Henseleit^15,16 (mKHB) يتم تهويته باستمرار بمزيج من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون. يقع mKHB في عائلة المخازن المؤقتة القلبية ^6,17 المستخدمة للحفاظ على الأنسجة المشرطة خارج الجسم ، على سبيل المثال ، في التجارب خارج الجسم الحي. لا تحتوي هذه المخازن المؤقتة على أي هيموغلوبين أو مضادات حيوية أو مضادات للفطريات ، وبالتالي فهي مناسبة فقط للمستحضرات التي تنطوي على كميات صغيرة من الأنسجة لفترة محدودة. تم تحقيق التحكم في الأس الهيدروجيني باستخدام زوج الأكسدة والاختزال الكربوني وثاني أكسيد الكربون ، مما يتطلب تهوية مستمرة للمخزن المؤقت مع ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على توازن الأس الهيدروجيني. هذا لتجنب استخدام عوامل التخزين المؤقت الشائعة الأخرى مثل HEPES ، والتي يمكن أن تعدل وظيفة الخلايا العصبية¹⁸. لأكسجة المخزن المؤقت وتوفير التحكم في درجة الحموضة ، تم استخدام خليط من 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الأكسجين يسمى carbogen (95٪ O 2 ، 5٪ CO₂). تم استخدام محرك تسخين للتحكم في درجة حرارة حاوية عازلة ، وتم تشغيل المخزن المؤقت من خلال حمام عصبي ، ثم أعيد تدويره إلى حاوية البداية. تستمر التجربة النموذجية من 6 إلى 8 ساعات قبل أن يفقد العصب قدرته على البقاء ولم يعد يستجيب بما فيه الكفاية للتحفيز لاتخاذ تدابير تمثل الأنسجة السليمة.

لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، تم استخدام أقطاب كلوريد الفضة للتسجيل ، والتي تم إعدادها وفقا للطرق الموصوفة سابقا¹⁹. للتحفيز ، يمكن استخدام مزيج من أقطاب الكفة البلاتينية التجارية الجاهزة وأقطاب الكفة البوليمرية الموصلة حسب الطلب. تتمتع أقطاب الكفة البوليمرية الموصلة بقدرات شحن أعلى بشكل ملحوظ ، وهي مفيدة عند تحفيز العصب باستخدام الأشكال الموجية عالية السعة²⁰.

تم وصف المحفز المستخدم في هذا البروتوكول سابقا²⁰. الوثائق وملفات التصميم والبرامج النصية لاستخدامها متاحة للجمهور²¹. يمكن استخدام محفزات أخرى لتنفيذ هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن المحفز المخصص قادر أيضا على كتلة التيار البديل عالي التردد (HFAC) ^2,20 ، والتي تمكن مجموعة واسعة من تجارب الفيزيولوجيا العصبية. لاستخدام كتلة HFAC ، يوصى باستخدام أساور مطاطية موصلة لتجنب تلف العصب. الأصفاد العصبية المطاطية الموصلة هي صفائف قطب كهربائية ناعمة وبوليمرية بالكامل يتم إنتاجها من اللدائن الموصلة كمكون موصل و polydimethylsiloxane كعازل²². تم تصنيع الأجهزة في تكوين ثنائي القطب باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق بالليزر التقليدية.