Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

L’attuale comprensione della funzione nervosa fondamentale come modellata in silico è carente in diversi aspetti, in particolare per quanto riguarda gli effetti della compartimentazione del tessuto nervoso al di fuori del soma, dell’assone e dei dendriti. Le interazioni assone-mielina sono ancora poco comprese, come evidenziato dal fatto che anche modelli nervosi computazionali dettagliati come MRG¹ (per i nervi dei mammiferi) che catturano adeguatamente la risposta di stimolazione elettrica convenzionale, non catturano altri comportamenti osservati sperimentalmente come il carryover di blocco ad alta frequenza² o la risposta di insorgenza secondaria³.

Questo protocollo fornisce un metodo per studiare in modo efficiente i processi neurofisiologici a livello nervoso in un modello acuto di piccoli animali da laboratorio, utilizzando un protocollo di preparazione standardizzato per isolare il nervo, controllarne l’ambiente e rimuoverlo da un contesto in vivo a un contesto ex vivo. Ciò impedirà altri processi corporei o anestetici utilizzati dai protocolli di stimolazione nervosa in vivo per alterare il comportamento nervoso e confondere i risultati misurati o la loro interpretazione ^4,5. Ciò consente lo sviluppo di modelli più realistici incentrati esclusivamente su effetti specifici dei tessuti nervosi che sono poco compresi. Questo protocollo è anche utile come banco di prova per la stimolazione nervosa e la registrazione di materiali e geometrie degli elettrodi, nonché nuovi paradigmi di stimolazione come il blocco ad alta frequenza ^2,3. Variazioni di questa tecnica sono state utilizzate in precedenza per studiare la fisiologia nervosa in condizioni strettamente controllate⁶, ad esempio, per misurare la dinamica e le proprietà dei canali ionici o gli effetti degli anestetici locali⁷.

Questa tecnica offre diversi vantaggi rispetto ad alternative come la sperimentazione acuta in vivo su piccoli animali⁸. La tecnica evita la necessità di mantenere la profondità dell’anestesia poiché il tessuto è stato estratto dal corpo, riducendo la quantità di attrezzature necessarie come un diffusore anestetico, un concentratore di ossigeno e una piastra riscaldante. Questo semplifica il protocollo sperimentale, riducendo il rischio di errori. Poiché gli anestetici possono potenzialmente alterare la funzione nervosa⁴, questa tecnica garantisce che le misure non siano confuse dagli effetti collaterali di questi composti anestetici. Infine, questa tecnica è più appropriata degli esperimenti acuti in vivo quando si studiano gli effetti di composti neurotossici come la tetrodotossina, che ucciderebbe un animale anestetizzato per paralisi.

Le sezioni nervose periferiche sono un sistema ex vivo unico poiché vi è un’alta probabilità che le fibre responsabili dei segnali neurali registrati non contengano alcun soma. Poiché questi sarebbero normalmente localizzati, per i motoneuroni, nella colonna vertebrale e per i neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale vicino alla colonna vertebrale, la preparazione di una sezione del nervo dei mammiferi può essere approssimativamente modellata come una raccolta di membrane tubolari con canali ionici, aperti ad entrambe le estremità⁹. Il metabolismo è mantenuto dai mitocondri situati nell’assone al momento della dissezione tissutale¹⁰. La sutura delle estremità aperte dell’axolemma è incoraggiata dopo l’estrazione per chiuderle e quindi aiutare a mantenere i gradienti ionici esistenti attraverso la membrana, che sono essenziali per la normale funzione nervosa.

Per mantenere l’omeostasi tissutale al di fuori del corpo, diverse variabili ambientali devono essere strettamente controllate. Questi sono temperatura¹¹, ossigenazione¹², osmolarità, pH^13,14 e accesso al glucosio per mantenere il metabolismo. Per questo protocollo, l’approccio consiste nell’utilizzare un tampone Krebs-Henseleit^{modificato 15,16} (mKHB) continuamente aerato con una miscela di ossigeno e anidride carbonica. L’mKHB fa parte della famiglia dei tamponi cardioplegici ^6,17 utilizzati per preservare i tessuti sezionati al di fuori del corpo, ad esempio in esperimenti ex vivo. Questi tamponi non contengono emoglobina, antibiotici o antifungini e sono, quindi, adatti solo per preparazioni che coinvolgono piccole quantità di tessuto per un tempo limitato. Il controllo del pH è stato ottenuto con la coppia redox carbonato e anidride carbonica, che richiede un’aerazione costante del tampone con anidride carbonica per mantenere l’equilibrio del pH. Questo per evitare l’uso di altri agenti tampone comuni come HEPES, che possono modificare la funzione delle cellule nervose¹⁸. Per ossigenare il tampone e fornire il controllo del pH, è stata utilizzata una miscela di anidride carbonica al 5% in ossigeno chiamata carbogeno (95_{% O} 2, 5% CO₂). Un agitatore di riscaldamento è stato utilizzato per il controllo della temperatura di un contenitore tampone e il tampone è stato perfuso attraverso un bagno nervoso e quindi rimesso in circolo nel contenitore di partenza. Un esperimento tipico durerebbe 6-8 ore prima che il nervo perda la sua vitalità e non risponda più sufficientemente alla stimolazione affinché le misure siano rappresentative del tessuto sano.

Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, per la registrazione sono stati utilizzati elettrodi di cloruro d’argento, che sono stati preparati secondo i metodi precedentemente descritti¹⁹. Per la stimolazione, è possibile utilizzare una combinazione di elettrodi commerciali per polsini in platino pronti all’uso e elettrodi per polsini in polimero conduttivo su misura. Gli elettrodi per polsini polimerici conduttivi hanno capacità di carica notevolmente più elevate, che sono utili quando si stimola il nervo utilizzando forme d’onda ad alta ampiezza²⁰.

Lo stimolatore utilizzato in questo protocollo è stato precedentemente descritto²⁰. Documentazione, file di progettazione e script software per utilizzarlo sono disponibili pubblicamente²¹. Altri stimolatori possono essere utilizzati per eseguire questo protocollo; tuttavia, lo stimolatore personalizzato è anche in grado di bloccare^{2,20 il blocco 2,20} di corrente alternativa ad alta frequenza (HFAC), che consente una gamma più ampia di esperimenti di neurofisiologia. Per utilizzare il blocco HFAC, si raccomandano polsini in elastomero conduttivo per evitare danni al nervo. I polsini nervosi in elastomero conduttivo sono array di elettrodi morbidi e completamente polimerici prodotti da elastomeri conduttivi come componente conduttivo e polidimetilsilossano come isolamento²². I dispositivi sono stati fabbricati in una configurazione bipolare utilizzando tecniche convenzionali di microfabbricazione laser.