Préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo

La compréhension actuelle de la fonction nerveuse fondamentale telle que modélisée in silico manque à plusieurs égards, notamment en ce qui concerne les effets de la compartimentation du tissu nerveux en dehors du soma, de l’axone et des dendrites. Les interactions axon-myéline sont encore mal comprises, comme en témoigne le fait que même des modèles nerveux computationnels détaillés tels que MRG¹ (pour les nerfs de mammifères) qui capturent correctement la réponse de stimulation électrique conventionnelle, ne capturent pas d’autres comportements observés expérimentalement tels que le transfert de bloc à haute fréquence² ou la réponse d’apparition secondaire³.

Ce protocole fournit une méthode pour étudier efficacement les processus neurophysiologiques au niveau nerveux dans un modèle aigu de petit animal de laboratoire, en utilisant un protocole de préparation standardisé pour isoler le nerf, contrôler son environnement et le faire passer d’un contexte in vivo à un contexte ex vivo. Cela empêchera d’autres processus corporels ou anesthésiques utilisés par les protocoles de stimulation nerveuse in vivo de modifier le comportement nerveux et de confondre les résultats mesurés ou leur interprétation ^4,5. Cela permet le développement de modèles plus réalistes se concentrant uniquement sur les effets spécifiques aux tissus nerveux mal compris. Ce protocole est également utile comme banc d’essai pour la nouvelle stimulation nerveuse et l’enregistrement des matériaux et des géométries des électrodes, ainsi que pour de nouveaux paradigmes de stimulation tels que le bloc^{haute fréquence 2,3}. Des variantes de cette technique ont déjà été utilisées pour étudier la physiologie nerveuse dans des conditions étroitement contrôlées⁶, par exemple, pour mesurer la dynamique et les propriétés des canaux ioniques ou les effets des anesthésiques locaux⁷.

Cette technique offre plusieurs avantages par rapport à des alternatives telles que l’expérimentation aiguë in vivo de petits animaux⁸. La technique évite d’avoir à maintenir la profondeur de l’anesthésie car le tissu a été extrait du corps, réduisant ainsi la quantité d’équipement requis tel qu’un diffuseur anesthésique, un concentrateur d’oxygène et un coussin chauffant. Cela simplifie le protocole expérimental, réduisant ainsi le risque d’erreurs. Comme les anesthésiques peuvent potentiellement altérer la fonction nerveuse⁴, cette technique garantit que les mesures ne seront pas confondues par les effets secondaires de ces composés anesthésiques. Enfin, cette technique est plus appropriée que les expériences in vivo aiguës lors de l’étude des effets de composés neurotoxiques tels que la tétrodotoxine, qui tueraient un animal anesthésié par paralysie.

Les sections nerveuses périphériques sont un système ex vivo unique car il y a de fortes chances que les fibres responsables des signaux neuronaux enregistrés ne contiennent pas de soma. Comme ceux-ci seraient normalement situés, pour les motoneurones, dans la colonne vertébrale, et pour les neurones sensoriels dans les ganglions de la racine dorsale à côté de la colonne vertébrale, la préparation d’une section du nerf mammifère peut être grossièrement modélisée comme une collection de membranes tubulaires avec des canaux ioniques, ouverts aux deux extrémités⁹. Le métabolisme est maintenu par les mitochondries situées dans l’axone au moment de la dissection tissulaire¹⁰. La suture des extrémités ouvertes de l’axolemme est encouragée après l’extraction pour les fermer et aider ainsi à maintenir les gradients ioniques existants à travers la membrane, qui sont essentiels pour le fonctionnement normal des nerfs.

Pour maintenir l’homéostasie tissulaire à l’extérieur du corps, plusieurs variables environnementales doivent être étroitement contrôlées. Il s’agit de la température¹¹, de l’oxygénation¹², de l’osmolarité, du pH^13,14 et de l’accès au glucose pour maintenir le métabolisme. Pour ce protocole, l’approche consiste à utiliser un tampon Krebs-Henseleit^{modifié 15,16} (mKHB) aéré en continu avec un mélange d’oxygène et de dioxyde de carbone. Le mKHB fait partie de la famille des tampons cardioplégiques ^6,17 utilisés pour préserver les tissus disséqués à l’extérieur du corps, par exemple dans des expériences ex vivo. Ces tampons ne contiennent pas d’hémoglobine, d’antibiotiques ou d’antifongiques et ne conviennent donc qu’aux préparations impliquant de petites quantités de tissu pendant un temps limité. Le contrôle du pH a été réalisé avec la paire redox carbonate et dioxyde de carbone, nécessitant une aération constante du tampon avec du dioxyde de carbone pour maintenir l’équilibre du pH. Il s’agit d’éviter d’utiliser d’autres agents tampons courants tels que HEPES, qui peuvent modifier la fonction des cellules nerveuses¹⁸. Pour oxygéner le tampon et contrôler le pH, un mélange de 5% de dioxyde de carbone dans l’oxygène appelé carbogène (95% O₂, 5% CO₂) a été utilisé. Un agitateur chauffant a été utilisé pour le contrôle de la température d’un récipient tampon, et le tampon a été perfusé à travers un bain nerveux, puis recirculé dans le récipient de départ. Une expérience typique durerait de 6 à 8 heures avant que le nerf ne perde sa viabilité et ne réponde plus suffisamment à la stimulation pour que les mesures soient représentatives des tissus sains.

Pour optimiser le rapport signal/bruit, des électrodes de chlorure d’argent ont été utilisées pour l’enregistrement, qui ont été préparées selon les méthodes décrites précédemment¹⁹. Pour la stimulation, une combinaison d’électrodes de brassard en platine prêtes à l’emploi et d’électrodes de brassard en polymère conducteur sur mesure peut être utilisée. Les électrodes conductrices à manchette en polymère ont des capacités de charge nettement plus élevées, ce qui est utile pour stimuler le nerf à l’aide de formes d’onde de haute amplitude²⁰.

Le stimulateur utilisé dans ce protocole a déjà été décrit²⁰. La documentation, les fichiers de conception et les scripts logiciels pour l’utiliser sont accessibles au public²¹. D’autres stimulateurs peuvent être utilisés pour exécuter ce protocole; cependant, le stimulateur personnalisé est également capable de bloc de courant alternatif à haute fréquence (HFAC) ^2,20, ce qui permet un plus large éventail d’expériences de neurophysiologie. Pour utiliser le bloc HFAC, des poignets en élastomère conducteurs sont recommandés pour éviter d’endommager le nerf. Les poignets nerveux en élastomère conducteur sont des réseaux d’électrodes souples et entièrement polymères produits à partir d’élastomères conducteurs comme composant conducteur et de polydiméthylsiloxane comme isolant²². Les dispositifs ont été fabriqués dans une configuration bipolaire en utilisant des techniques conventionnelles de microfabrication laser.