Подготовка седалищного нерва крысы к нейрофизиологии Ex Vivo

Современное понимание фундаментальной функции нерва, смоделированной in silico , отсутствует в нескольких аспектах, особенно в отношении эффектов компартментализации нервной ткани за пределами сомы, аксона и дендритов. Взаимодействия аксон-миелин все еще плохо изучены, о чем свидетельствует тот факт, что даже подробные вычислительные модели нервов, такие как MRG¹ (для нервов млекопитающих), которые адекватно захватывают обычный ответ электрической стимуляции, не фиксируют другие экспериментально наблюдаемые модели поведения, такие как перенос высокочастотного блока² или вторичный ответ начала³.

Этот протокол обеспечивает метод эффективного исследования нейрофизиологических процессов на нервном уровне в острой модели малых лабораторных животных, используя стандартизированный протокол подготовки для изоляции нерва, контроля его окружающей среды и удаления его из контекста in vivo в контекст ex vivo. Это предотвратит другие процессы в организме или анестетики, используемые протоколами стимуляции нервов in vivo для изменения поведения нервов и искажения измеренных результатов или их интерпретации ^4,5. Это позволяет разрабатывать более реалистичные модели, ориентированные исключительно на эффекты, специфичные для нервных тканей, которые плохо изучены. Этот протокол также полезен в качестве испытательного стенда для новой стимуляции нервов и регистрации электродных материалов и геометрии, а также новых парадигм стимуляции, таких как высокочастотный блок ^2,3. Вариации этого метода ранее использовались для изучения физиологии нервов в жестко контролируемых условиях⁶, например, для измерения динамики и свойств ионных каналов или эффектов местных анестетиков⁷.

Этот метод обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с альтернативами, такими как острые эксперименты in vivo на мелких животных⁸. Этот метод устраняет необходимость поддержания глубины анестезии, поскольку ткань была извлечена из организма, уменьшая количество необходимого оборудования, такого как диффузор анестезии, концентратор кислорода и грелка. Это упрощает экспериментальный протокол, снижая риск ошибок. Поскольку анестетики могут потенциально изменять функцию нерва⁴, этот метод гарантирует, что меры не будут смешаны побочными эффектами от этих анестезирующих соединений. Наконец, этот метод более уместен, чем острые эксперименты in vivo при изучении эффектов нейротоксичных соединений, таких как тетродотоксин, которые убивают обезболенное животное параличом.

Периферические нервные участки являются уникальной системой ex vivo , поскольку существует высокая вероятность того, что волокна, ответственные за записанные нейронные сигналы, не содержат никакой сомы. Поскольку они обычно расположены, для двигательных нейронов в позвоночнике и для сенсорных нейронов в дорсальных корневых ганглиях рядом с позвоночником, подготовка участка нерва млекопитающих может быть грубо смоделирована как набор трубчатых мембран с ионными каналами, открытыми на обоих концах⁹. Метаболизм поддерживается митохондриями, расположенными в аксоне в момент рассечения ткани¹⁰. Швы открытых концов аксолеммы поощряются после экстракции, чтобы закрыть их и тем самым помочь поддерживать существующие ионные градиенты по всей мембране, которые необходимы для нормальной функции нерва.

Чтобы поддерживать тканевый гомеостаз вне организма, необходимо жестко контролировать несколько переменных окружающей среды. Это температура¹¹, оксигенация¹², осмолярность, рН^13,14 и доступ к глюкозе для поддержания метаболизма. Для этого протокола подход заключается в использовании модифицированного буфера Кребса-Хенселейта^15,16 (mKHB), непрерывно аэрированного смесью кислорода и углекислого газа. MKHB относится к семейству кардиоплегических буферов ^6,17, используемых для сохранения рассеченных тканей вне организма, например, в экспериментах ex vivo. Эти буферы не содержат гемоглобина, антибиотиков или противогрибковых препаратов и, следовательно, подходят только для препаратов с участием небольших количеств ткани в течение ограниченного времени. Контроль pH был достигнут с помощью карбонатной и углекислотной окислительно-восстановительной пары, требующей постоянной аэрации буфера углекислым газом для поддержания равновесия рН. Это делается для того, чтобы избежать использования других распространенных буферных агентов, таких как HEPES, которые могут модифицировать функцию нервных клеток¹⁸. Для насыщения буфера кислородом и обеспечения контроля рН использовалась смесь 5% углекислого газа в кислороде, называемая карбогеном (95% O₂, 5% CO₂). Нагревательную мешалку использовали для контроля температуры буферного контейнера, и буфер перфузировали через нервную ванну, а затем рециркулировали в исходный контейнер. Типичный эксперимент будет длиться 6-8 часов, прежде чем нерв потеряет свою жизнеспособность и больше не будет достаточно реагировать на стимуляцию, чтобы меры были репрезентативными для здоровой ткани.

Для оптимизации отношения сигнал/шум для записи использовали серебристо-хлоридные электроды, которые готовили согласно ранее описанным способам¹⁹. Для стимуляции может использоваться комбинация коммерческих готовых платиновых манжетных электродов и изготовленных на заказ проводящих полимерных манжетных электродов. Проводящие полимерные манжеты электроды имеют заметно более высокую емкость заряда, которые полезны при стимуляции нерва с использованием высокоамплитудных сигналов²⁰.

Стимулятор, используемый в этом протоколе, был ранее описан²⁰. Документация, файлы проектирования и программные сценарии для его использования являются общедоступными²¹. Другие стимуляторы могут быть использованы для выполнения этого протокола; однако пользовательский стимулятор также способен использовать блок^2,20 высокочастотного альтернативного тока (HFAC), что позволяет проводить более широкий спектр нейрофизиологических экспериментов. Для использования блока HFAC рекомендуются проводящие эластомерные манжеты, чтобы избежать повреждения нерва. Манжеты проводящих эластомерных нервов представляют собой мягкие и полностью полимерные электродные массивы, изготовленные из проводящих эластомеров в качестве проводящего компонента и полидиметилсилоксана в качестве изоляции²². Устройства были изготовлены в биполярной конфигурации с использованием обычных методов лазерного микропроизводства.